Малый практикум по микробиологии (стр. 17 )

Задание 1. Приготовить мясо-пептонный агар (МПА), установить необходимый рН при помощи растворов NaOH (или HCl) и разлить в пробирки.

Задание 2. Три пробирки с 5 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) засеять 0,1 мл суспензии Pseudomonas aeruginosa. По одной пробирке поставить в термостаты для культивирования при разных температурах (30; 37 и 42 °С). Через 7 суток учитывают результаты, определяя интенсивность роста культуры при разных температурных режимах, делают вывод о наиболее оптимальных условиях инкубирования.

Задание 3. Посеять культуру P. putida в 2 пробирки с синтетической средой следующего состава (г/л): глюкоза – 20,0; NH4Cl – 1,0; K2HPO4 – 2,0; MgSO4∙7H2O – 0,5; дрожжевая вода – 2 мл. В одну пробирку внести стерильный мел, перед посевом измерить рН в каждой пробирке. Засеянные пробирки поместить в термостат на 30 °С.

На 7-е сутки культивирования определяют значение рН в средах, дают визуальную оценку роста. Данные заносят в таблицу 4:

Таблица 4

Влияние рН среды на рост P. putida

Синтетическая среда	Значение рН	Интенсивность роста культуры
До посева	После 7-суток культивирования
Без мела
С мелом

Примечание: +++ - обильный рост; ++ - умеренный; + - скудный, - - отсутствие роста.

Материалы и оборудование. Весы с разновесом; колбы, цилиндры мерные, стакан химический, пробирки с ватно-марлевыми пробками; мясо-пептонный бульон, агар; универсальный рН-индикатор, капельницы с 10%-ными растворами NaOH и HCl; водяная баня, штатив, пробирки со стерильным МПБ и синтетической средой, стерильный мел; стерильные пипетки на 1 мл, спиртовка, бактериальная петля, дезинфицирующий раствор.

Демонстрация: качалки, колбы для качалок, «матрацы».

Вопросы:

1.  Какие источники энергии используют фототрофы и хемотрофы? Что следует учитывать при культивировании хемолитотрфов и хемоорганотрофов?

2.  Какие источники углерода должна содержать среда для выращивания гетеротрофных микроорганизмов? Как культивируют автотрофные микроорганизмы?

3.  Какие соединения могут использовать микроорганизмы в качестве источника азота, фосфора и серы?

4.  Что необходимо учитывать при культивировании ауксотрофов?

5.  Рассказать о классификации сред по составу, назначению и физическому состоянию.

6.  Каким образом корректируют рН среды? С какой целью в питательную среду добавляют буферные растворы?

7.  Как культивируют психрофильные, мезофильные и термофильные микроорганизмы?

8.  Как культивируют аэробные и анаэробные микроорганизмы?

ТЕМА 10. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРОКАРИОТ

(Занятия 10-12)

Цель занятий 10-12: знакомство с основными принципами идентификации бактерий.

Каждый студент получает культуру бактерий в пробирке на скошенном рыбо-пептонном агаре (РПА). В процессе выполнения практической работы изучаются морфологические, тинкториальные, культуральные и физиолого-биохимические свойства бактериального штамма, необходимые для идентификации его до уровня рода.

Систематика и идентификация прокариот

Систематика – это биологическая наука о принципах распределения организмов по соподчиненным группам (таксонам). Систематика включает такие разделы как номенклатура, классификация и идентификация.

Номенклатура – это совокупность принципов, правил и рекомендаций для установления названий. Образование и употребление научных названий бактерий регламентируется Международным кодексом номенклатуры бактерий – МКНБ (International Code of Nomenclature of Bacteria, ICNB). Для наименования вида используют бинарную номенклатуру. Родовое название пишется с прописной буквы, видовой эпитет – со строчной буквы. При повторном упоминании микроорганизма родовое название сокращают до одной начальной буквы. Например, Bacillus thuringiensis после первого упоминания в тексте пишут: B. thuringiensis. Если микроорганизм идентифицирован только до рода, вместо видового эпитета пишут слово sp. (species – вид), например, Pseudomonas sp. В этом случае при повторном упоминании названия микроорганизма в тексте родовое название следует писать полностью.

Для наименования подвида используют словосочетание, состоящее из названия рода, видового и подвидового эпитета. Для разграничения этих эпитетов между ними пишут ssp. (или subsp.) (subspecies – подвид). Например, Bacillus thuringiensis ssp. alesti.

Классификация определяет порядок помещения организмов, обладающих заданной степенью однородности, в определенные таксоны. Классификация осуществляется по иерархической системе. Низшей инфраподвидовой систематической категорией у бактерий является штамм.

Штамм – это идентифицированная чистая культура какого-либо вида или подвида, выделенная из того или иного источника (организма человека, из почвы, воды и т. д.). Штамм может отличаться от других штаммов этого вида одним или несколькими малосущественными признаками. Типовой штамм является номенклатурным типом вида, за ним закреплено видовое название. Типовые штаммы хранятся в соответствующих коллекциях микроорганизмов.

Штаммы объединяются в подвид (subspecies). В систематике бактерий широко применяют понятие «вариант». Вариант (инфравидовая систематическая категория) – это группа штаммов, отличающихся от типового для данного вида штамма одним или несколькими стабильными существенными признаками. Различают морфовары с разной морфологией колоний (R – шероховатые, S – гладкие, M – слизистые колонии); серовары, отличающиеся по антигенной структуре; резистенсвары, обладающие разной устойчивостью к антибиотикам; фаговары, имеющие разную чувствительность к фагам и т. д.

Подвиды объединяют в вид (species). Вид – это совокупность штаммов с высоким уровнем сходства последовательностей ДНК и фенотипических признаков. Виды объединяют в таксономические категории более высокого порядка: роды (genus), семейства (familia), порядки (ordo), классы (classis), отделы (phylum), царства (regnum).

Идентификация – это определение систематического положения выделенной из какого-либо источника культуры до уровня вида или варианта.

Первый шаг при идентификации – получение чистой культуры. Чистая культура – совокупность особей одного вида или варианта. Является результатом искусственной инокуляции среды и последующей ее инкубации.

Для идентификации бактерий используют комплекс признаков:

Морфологическая характеристика и организация клеток бактерий (форма, размеры клетки, характер соединения в агрегаты; подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования; способность образовывать споры, тип спорообразования; наличие капсулы, особенности внутриклеточного строения, наличие включений в клетке).

Тинкториальные признаки связаны с особенностями химического состава клеточной стенки бактерий. К тинкториальным признакам относится способность бактерий окрашиваться по Граму и тест на кислотоустойчивость.

Культуральные свойства – особенности роста чистой культуры на плотных и жидких питательных средах.

Физиолого-биохимические признаки включают:

Установление типа обмена исследуемой бактерии (фото - или хемотрофия; лито - или органотрофия, авто - или гетеротрофия) с указанием типа энергетического метаболизма (способность к брожению, аэробному или анаэробному дыханию, фотосинтезу). Изучение способности использовать соединения углерода, азота и серы; ферментативной деградации и трансформации различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов; потребности в витаминах и других факторах роста. Определение отношения к факторам среды: к О2, температуре, рН среды, солености, освещенности и другим факторам.

Серологические свойства различных бактерий достаточно специфичны и обусловлены особенностями строения клеточных структур, распознаваемых специфическими антисыворотками как антигенные детерминанты. Антигены (Аг) – это вещества различного происхождения, несущие признаки генетической чужеродности и вызывающие развитие иммунных реакций. Свойства Аг определяют их иммуногенность – способность индуцировать иммунный ответ и антигенность – способность Аг избирательно реагировать со специфическими к нему антителами или антигенраспознающими рецепторами лимфоцитов. Антигенность обуславливается участком молекулы Аг – эпитопом (антигенная детерминанта), который индуцирует иммунный ответ и определяет его специфичность. Аг могут быть белки, полисахариды, липополисахариды, липиды, нуклеиновые кислоты. В зависимости от локализации у бактерий выделяют несколько групп Аг: капсульные, Н-антигены (жгутиковые), О-антигены (соматические) и др.

Антитела (АТ) синтезируются при стимуляции Аг, поступающих в организм. АТ представлены сывороточными гликопротеинами. Антигенсвязывающий центр АТ комплементарен эпитопу Аг по принципу «ключ-замок». АТ способны специфически взаимодействовать с комплементарными Аг.

Для серодиагностики используют диагностические антисыворотки. Это иммунные сыворотки, содержащие АТ против одного (моновалентные, моноспецифические) или нескольких (поливалентные, полиспецифические) Аг. Получают их путем иммунизации животных (кроликов, лошадей и др.)

Серологический метод – это совокупность пробирочных реакций, основанных на Аг-АТ-взаимодействии (соединение молекул Аг и АТ в комплекс). Серотипирование обычно проводят в реакции агглютинации, которая заключается в процессе склеивания антигеннесущих корпускулярных частиц (бактерий) молекулами гомологичных АТ в присутствии электролита, в результате чего образуется агглютинат. Для постановки реакции агглютинации необходимы антисыворотка и Аг. Реакцию проводят объемным или капельным методом, смешивая определенные объемы антисыворотки и бактериальной суспензии. Положительная реакция выражается в появлении агглютината в исходно однородной суспензии.