Малый практикум по микробиологии (стр. 22 )

Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку, во избежание получения ошибочного результата.

Рис. 53. Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов шпателем

Посев на агаризованные среды в чашки Петри

Высевать суспензию можно поверхностным или глубинным способом.

Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную агаризованную питательную среду в стерильные чашки Петри по 15–20 мл в каждую. Чашки оставляют, пока среда не застынет. Поверхность перед посевом рекомендуется подсушить, чтобы не было конденсата. После того, как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его по поверхности питательной среды стерильным стеклянным шпателем (рис. 53). Высевы проводят их трех последних разведений, при этом из каждого делают 2–4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают для культивирования микроорганизмов в термостат при 30 °С крышками вниз.

Подсчет выросших колоний

Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 2 – 15 суток культивирования. Подсчет проводят с помощью лупы, не открывая чашки Петри, при этом чашку кладут вверх дном на темный лист бумаги (обеспечивая тем самым лучшую видимость колоний). Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты.

Следует иметь в виду, что точность метода зависит от числа подсчитанных колоний, а не от числа повторностей. Лучшим разведением следует считать то, при высеве которого в чашке Петри вырастает от 30–50 до 100 – 150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

,

где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число колоний при высеве разведения, из которого сделан высев; V – объем суспензии, взятой для посева, в мл; 10n – коэффициент разведения.

Задание 1. Провести учет общего количества микроорганизмов в почве. Для этого:

·  подготовить образец почвы к анализу,

·  приготовить почвенную суспензию,

·  приготовить ряд последовательных разведений почвенной суспензии,

·  произвести поверхностный посев из соответствующих разведений на среду МПА,

·  поместить чашки Петри с посевами в термостат крышками вниз и культивировать при 30 °С в течение 7 суток.

Материалы и оборудование: проба почвы, стерильные чашки Петри, стерильные пакеты, фарфоровая чашка, часовые стекла, шпатели металлические, нож, пинцет, резиновые перчатки, весы технические с разновесом, стерильные пипетки на 1–2 мл, микропипетки, спиртовка, вата, этанол 96%-ный, колбы на 250 мл, пробирки с 9 мл стерильной воды, кристаллизатор, чашки Петри с МПА, стерильный шпатель. Весы с разновесом, Микроскопы. Предметные стекла, фильтровальная бумага, колба с водой, бактериальная петля, маркер, фуксин основной или генциан фиолетовый, миллиметровая бумага, пробирка со стерильной водой.

Вопросы:

1.  В чем отличие косвенных методов от прямых?

2.  Какие методы косвенного учета вы знаете?

3.  В каких случаях применяют косвенные методы количественного учета?

4.  Как подготовить почву к микробиологическому исследованию?

Тема 11. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ (ПРОДОЛЖЕНИЕ)

Занятие 15

Учет результатов

Задание 1. Подсчитать количество выросших колоний на чашках Петри с МПА и произвести расчет количества микроорганизмов в 1 мл исследуемой суспензии по соответствующей формуле (см. Занятие 14).

Задание 2. Выявить морфологическое разнообразие гетеротрофных микроорганизмов, выросших на МПА. Описать преобладающие в количественном отношении колонии.

Результаты занести в таблицу 6:

Таблица 6

Признаки колоний микроорганизмов, выросших на МПА

№ п/п	Форма	Размер	Оптические свойства	Цвет	Поверхность	Профиль	Край колонии	Структура	Консистенция	Способность к эмульгированию	Микроскопическая картина
1
2
3

Задание 3. Промикроскопировать описанные колонии, приготовив препарат «раздавленная капля». Препараты просмотреть с иммерсионным объективом (90×), определить форму и сочетание клеток, данные занести в таблицу 5. Сделать вывод о преобладающих формах микроорганизмов в исследуемом субстрате.

Задание 4. Написать отчет по теме «Определение количества клеток микроорганизмов в образце почвы».

Материалы и оборудование: предметные и покровные стекла, бактериологическая петля, пинцет, пробирка со стерильной водой, стерильная пипетка на 1-2 мл, вата, кристаллизатор, спиртовка, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага, маркеры, микроскоп, лупы, иммерсионное масло.

Вопросы:

1.  Как правильно произвести подсчет выросших на чашках Петри колоний микроорганизмов?

2.  Как определить количество жизнеспособных клеток микроорганизмов в почве?

ПЛАН СЕМИНАРСКИХ ЗАНЯТИЙ

Занятие 1

Тема. Методы микроскопического исследования микроорганизмов. Бактерии. Актиномицеты. Микроскопические грибы

Вопросы для обсуждения:

1. Световой микроскоп: устройство и принцип работы, общее увеличение и разрешающая способность микроскопа.

2. Методы приготовления микроскопических препаратов для световой микроскопии («раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток», фиксированный окрашенный препарат).

3. Фазово-контрастная, темнопольная, люминесцентная микроскопия. Принцип устройства, преимущества и назначение.

4. Принцип устройства и работы просвечивающего электронного микроскопа. Сканирующая электронная микроскопия. Ультратонкие срезы. Сущность методов «замораживание – скалывание» и «замораживание – травление».

5. Строение бактериальной клетки.

6. Клеточные стенки прокариот. Грамположительные и грамотрицательные бактерии. Методика окраски бактерий по Граму.

7. Выявление капсул у прокариот. Сущность метода «негативного контрастирования».

8. Морфологически дифференцированные клетки прокариот. Образование эндоспор, их строение, химический состав, свойства. Методы обнаружения спор. Окраска спор по Пешкову.

9. Морфология прокариот.

10. Актиномицеты, их морфологические и культуральные свойства. Способы размножения. Распространение и роль в природе, значение для человека.

11. Микроскопические грибы. Особенности морфологии. Способы размножения. Систематика грибов. Экологические группы грибов. Дрожжи: морфология, способы размножения, практическое использование.

Занятие 2

Тема. Методы стерилизации. Принцип приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов. Идентификация прокариот

Вопросы для обсуждения:

1. Стерилизация и дезинфекция. Методы стерилизации. Устройство и режим работы автоклава.

2. Принцип приготовления питательных сред. Пищевые потребности прокариот. Классификация сред по составу, назначению и физическому состоянию.

4. Условия культивирования микроорганизмов.

5. Систематика прокариот. Номенклатура и классификация. Понятия «клон», «штамм», «вариант». Понятие вида у прокариот.

6. Идентификация прокариот.

Занятие 3

Тема. Метаболизм прокариот

Вопросы для обсуждения:

1. Типы энергетического и конструктивного метаболизма прокариот. Фототрофия и хемотрофия. Литотрофия и органотрофия. Автотрофия и гетеротрофия. Способы существования прокариот (8 типов). Облигатный и факультативный тип метаболизма.

2. Гомоферментативное молочнокислое брожение. Биохимия процесса. Характеристика гомоферментативных молочнокислых бактерий. Использование в пищевой промышленности.

3. Спиртовое брожение. Образование этанола дрожжами. Характеристика дрожжей, промышленное использование. Образование этанола бактериями.

4. Пропионовокислое брожение. Биохимия процесса. Характеристика пропионовокислых бактерий. Практическое использование.

5. Маслянокислое брожение. Биохимия процесса. Характеристика бактерий р. Clostridium. Сахаролитические, протеолитические, пуринолитические клостридии. Распространение и значение клостридиев в природе. Практическое использование.

6. Гетероферментативное молочнокислое брожение. Биохимия процесса. Характеристика гетероферментативных молочнокислых бактерий, распространение и роль в природе, использование в пищевой промышленности.

7. Бактериальный фотосинтез. Механизм аноксигенного фотосинтеза. Характеристика аноксигенных фототрофных бактерий.

8. Хемосинтез. Группы хемолитотрофных прокариот (нитрифицирующие, тионовые, водородные бактерии, железобактерии, карбоксидобактерии). Дыхательные цепи хемолитотрофных прокариот.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.  Гусев : Учеб. для студ. биол. специальностей вузов / , . – 4-е изд. – М.: Академия, 2003. – 463 с.