Малый практикум по микробиологии (стр. 15 )

Рис. 37. Прибор Зейтца (а) и схема работы мембранных (поверхностных) фильтров (б):

1 – крупнопористая стеклянная или металлическая пластинка, 2 и 3 – верхняя и нижняя часть

аппарата Зейтца, 4 –разрежение, 5 – резиновая пробка, 6 – колба Бунзена, 7 – микробные клетки,

8 – мембранный фильтр, 9 - фильтрат

Рис. 38. Прибор для фильтрования с применением свечи Шамберлана:

1- сосуд с фильтрующей жидкостью, 2 – свеча Шамберлана, 3 – резиновая пробка, 4 – колба Бунзена

Химические методы стерилизации

Химическая стерилизация проводится с помощью химических веществ, обладающих биоцидным действием. Такие вещества называются стерилизантами. В настоящее время в качестве стерилизантов используют 2%-ный щелочной водный раствор глютаральдегида и 20%-ный раствор формальдегида в 70%-ном этаноле. Глютаральдегид и формальдегид уничтожают вегетативные и споровые формы всех микроорганизмов. Химическая стерилизация проводится путем полного погружения объекта в раствор на длительное время (около 10 часов) при комнатной температуре. Для газовой стерилизации используют этиленоксид. Это бесцветный газ, при невысокой концентрации без запаха. Уничтожает все формы микроорганизмов, включая споры. Применение этих методов ограничено из-за токсичности стерилизантов, длительности процесса и некоторых других сложностей.

В лабораторной практике в качестве дезинфицирующих растворов для обработки рабочего стола, поверхностей различных предметов используют 5%-ный раствор карболовой кислоты, 5%-ный раствор крезола и лизола и ряд других веществ.

Задание 1. Ознакомиться с работой автоклава, сушильного шкафа, бактериальных фильтров.

Задание 2. Подготовить к стерилизации чашки Петри, пробирки, шпатели Дригальского, пипетки на 1 и 10 мл, микропипетки. Подготовить к стерилизации воду в пробирках (по 10 мл).

Задание 3. Приготовить ватно-марлевые пробки к пробиркам.

Материалы и оборудование. Чашки Петри, пробирки, шпатели Дригальского, пипетки на 1 и 10 мл, микропипетки, штативы для пробирок, ножницы, препаровальные иглы, вата, марля, бумага.

Демонстрация: Автоклав, сушильный шкаф, мембранные и асбестовые фильтры.

Вопросы:

1.  Что такое стерилизация? Какова цель стерилизации?

2.  Использование высоких температур для стерилизации. В чем заключается стерилизация сухим жаром?

3.  В чем заключается стерилизация текучим паром? Описать устройство и режим работы автоклава.

4.  Какие принципы лежат в основе тиндализации? Для стерилизации каких сред и субстратов применяется?

5.  Для каких целей используют ультрафиолетовое, γ- и рентгеновское излучение?

6.  Какова сущность стерилизации фильтрованием? Для стерилизации каких материалов используется? Какие бактериальные фильтры знаете?

7.  Что такое стерилизанты? Какие стерилизанты применяются в химической стерилизации?

ТЕМА 9. ПРИНЦИПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Занятие 9

Цель занятия: знакомство с принципом составления питательных сред для выращивания микроорганизмов, с условиями культивирования.

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. Культивирование основано на знании метаболизма микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды для их жизнедеятельности.

Принцип составления сред для культивирования микроорганизмов

Потребности микроорганизмов в питательных веществах чрезвычайно разнообразны и определяются особенностями их метаболизма. При составлении питательной среды необходимо учитывать следующие факторы.

Источник энергии, доступный для микроорганизма. Для фототрофов источником энергии служит свет, для хемоорганотрофов – окисление органических, для хемолитотрофов – неорганических веществ.

Источник углерода. По потребностям в углероде микроорганизмы принято делить на две группы – автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные микроорганизмы способны использовать в качестве единственного источника углерода углекислоту. В соответствии с этим в среды для культивирования автотрофов вносят бикарбонат натрия (NaHCO3) или карбонаты, чаще всего углекислый кальций (CaCO3). В некоторых случаях через среду продувают стерильный воздух, искусственно обогащенный 1 – 5 % СО2. Для развития гетеротрофных микроорганизмов среда должна содержать органические соединения. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различные соединения углерода – органические кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения. Часто для гетеротрофов одно и то же органическое вещество служит и источником углерода, и источником энергии, т. е. по типу обмена они являются хемоорганогетеротрофами.

Источник азота. Для многих микроорганизмов источником азота могут служить соли аммония. В этом случае в среду вносят NH4Cl или (NH4)2SO4. Если микроорганизм использует азот нитратов, то в питательную среду добавляют KNO3 или NaNO3.

При культивировании микроорганизмов, более требовательных к азоту и, соответственно, обладающих меньшими биосинтетическими возможностями, в среду добавляют одну, несколько или полный набор аминокислот. Потребности микроорганизмов в нескольких аминокислотах часто удовлетворяют, добавляя к питательной среде гидролизат белка. Для получения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыба, желатин, казеин) или растительного (дрожжи, водоросли, бактерии) происхождения. Чаще всего используют гидролизат казеина.

Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления – пептоны. Пептоны представляют собой смесь поли - и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований, солей и микроэлементов. Их получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного (мышечный белок, казеин) или растительного происхождения (соевая мука). Аминокислоты и пептон могут использоваться микроорганизмами не только как источник азота, но и как источник углерода и энергии.

Азотфиксирующие бактерии способны использовать в качестве источника углерода молекулярный азот воздуха. В среды для культивирования таких бактерий источники азота не вносят.

Факторы роста. Многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся пурины, пиримидины, аминокислоты, витамины. Для того, чтобы подчеркнуть потребность микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термины «прототрофы» и «ауксотрофы». Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста. Набор различных факторов роста содержится в дрожжевом, кукурузном экстракте, дрожжевом автолизате.

Источники фосфора, серы и других элементов. Потребности микроорганизмов в фосфоре удовлетворяются за счет солей фосфорной кислоты. Для большинства микроорганизмов источником серы являются сульфаты. Источником магния служит MgSO4, натрия и хлора – NaCl, кальция – CaCO3 или CaCl2. Железо вносится в среды в виде хлорида, сульфата или цитрата. Микроэлементы (марганец, молибден, цинк и т. д.) вносят в среды строго определенного состава, приготовленные на дистиллированной воде в количестве от 1 мг до 1 мкг на 1 л.

Классификация сред

По составу принято выделять натуральные, синтетические и полусинтетические среды. Натуральными называют среды, состоящие из продуктов животного или растительного происхождения. К таким средам относятся овощные, фруктовые соки, экстракты животных и растительных тканей, молоко, кровь, сыворотка, желчь и т. д. Эти среды имеют сложный, непостоянный состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов. Натуральные среды используются для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы, для диагностических целей. В лабораторных условиях широко применяются такие натуральные среды, как мясо-пептонный бульон, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среда.

К натуральным относят также полусинтетические среды. Главными компонентами этих сред являются соединения известного химического состава – углеводы, соли аммония или нитраты, фосфаты и т. д. Но наряду с ними в состав среды входят вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и т. д. Эти среды находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Синтетические среды – это среды, в состав которых входят соединения определенного химического состава в точно указанных количествах. Эти среды используются при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов. К синтетическим средам относятся разнообразные среды, например, среда Чапека, среда Эшби, среда Раймонда и т. д.

По назначению различают среды общего и специального назначения (элективные и дифференциально-диагностические). Среды общего назначения используются для текущих пересевов, для поддержания культур в лабораторных условиях, для наращивания биомассы.

Элективные среды применяют для первичного посева материала. Они удобны для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. Элективные среды готовят с учетом биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов, поэтому они обеспечивают преимущественное развитие определенной группы микроорганизмов. Например, элективной средой для актиномицетов является крахмал-аммиачный агар или среда Гаузе, для грибов – среда Чапека или сусло-агар, для азотфиксирующих бактерий – среда Эшби, не содержащая источников азота.

Дифференциально-диагностические среды предназначены для изучения и индикации отдельных видов и групп микроорганизмов. В качестве основы эти среды содержат углеводы, спирты, мочевину, белки и т. д. При расщеплении этих веществ происходит сдвиг рН, который фиксируется по изменению окраски индикатора, входящего в состав среды. Примером дифференциально-диагностической среды является среда Эндо, которая позволяет идентифицировать бактерии группы кишечных палочек.