Малый практикум по микробиологии (стр. 4 )

Различные виды прокариот можно идентифицировать с помощью флуоресцентно меченных антител. Особый интерес вызывает флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), образующий связь с белками антител без нарушения их способности соединяться с гомологичными антигенами. Меченные ФИТЦ антитела представляют собой высокочувствительные индикаторы на соответствующие антигены. Антитела получают общепринятыми методами из крови иммунизированных кроликов и затем флуорохромируют.

В люминесцентном микроскопе люминесценция возбуждается сине-фиолетовыми лучами и ближним ультрафиолетом. Оптическая схема люминесцентных микроскопов позволяет наблюдать объекты при освещении их как в проходящем, так и падающем свете. В современных люминесцентных микроскопах возбуждающий люминесценцию свет направляется на препарат сверху, через объектив (МИКМЕД 2, ЛЮМАА РПО 11 – ОМО, Санкт-Петербург, Россия; «Axioscop» - Zeiss, Jena, Germany). При освещении объектов сверху (для возбуждения люминесценции) одновременно допускается освещение объектов снизу с помощью конденсора темного поля или фазово-контрастного устройства. Устройство люминесцентного микроскопа и порядок работы даны в описании каждой конкретной модели.

Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изображения, дает возможность различить отдельные клеточные структуры и даже отметить их изменения при различных функциональных состояниях клетки. Этот вид микроскопии широко используется для выявления и учета живых и мертвых клеток микроорганизмов в природных субстратах, а также для цитологических исследований клеток.

Методы приготовления микроскопических препаратов

Препараты готовят на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,2–1,4 мм. Существенным моментом при приготовлении препаратов является подготовка поверхности стекла (особенно при изготовлении фиксированных окрашенных препаратов). Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, так чтобы капля жидкости равномерно растекалась по стеклу, а не собиралась в выпуклые капли. Наиболее эффективный способ обезжиривания – обработка стекол хромовой смесью с последующим ополаскиванием водой и спиртом. В повседневной практике стекла обезжиривают следующим образом. Сухое чистое стекло натирают мылом, после чего его тщательно протирают хлопчатобумажной салфеткой. Перед приготовлением препарата стекло рекомендуется профламбировать в пламени спиртовки. Чистые обезжиренные стекла можно хранить в сухом состоянии или в этаноле.

Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15– 0,17 мм. Стекла, используемые для препарата, должны быть чистыми и сухими.

Клетки микроорганизмов для приготовления микроскопических препаратов берут бактериологической петлей или иглой, если микроорганизмы выращены на плотной среде.

Если микроорганизмы выращены в жидкой питательной среде, можно использовать стерильную пипетку. Бактериологические петли делают, используя тонкую проволоку из платины или нихрома, которую закрепляют в металлическом держателе. Диаметр бактериологической петли 4 – 5 мм.

Бактериологическую петлю (иглу) перед взятием клеток микроорганизмов стерилизуют. Для этого проволоку прокаливают докрасна в пламени спиртовки и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя. Петлю следует держать в пламени спиртовки вертикально, чтобы проволока была равномерно раскалена на всем протяжении. При прокаливании следует помнить, что наивысшая температура развивается в верхней и периферической частях пламени. Сразу же после стерилизации петлю (иглу) вводят в сосуд с микроорганизмами. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю (иглу) вначале охлаждают, прикасаясь ею к внутренней поверхности сосуда или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого захватывают небольшое количество микробной массы, которую используют для приготовления препарата. Оставшуюся на петле после этих манипуляций биомассу сжигают в пламени спиртовки. Прокаливание петли в этом случае начинают с участка проволоки, примыкающего к кольцу, для того, чтобы микробная масса подсохла. Затем петлю переводят в вертикальное положение и прокаливают докрасна. При быстром нагревании влажной микробной массы происходит ее разбрызгивание и образуется микробный аэрозоль, загрязняющий воздух.

Выделяют две группы микроскопических препаратов: нативные и фиксированные окрашенные.

Нативные препараты

Нативные препараты используют для изучения морфологии живых клеток: формы, размеров, характера соединения в агрегаты, определения подвижности.

Наиболее распространенные препараты этой группы: «раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток». Для прижизненного исследования микроорганизмов используют фазово-контрастную и темнопольную микроскопию.

Препарат «раздавленная капля». На предметное стекло стерильной пипеткой наносят каплю стерильной воды, в которую петлей вносят небольшое количество бактериальной массы, суспендируют и покрывают покровным стеклом. При опускании стекла на каплю для предотвращения образования пузырьков воздуха сначала прикасаются ребром покровного стекла к краю капли, а затем, постепенно наклоняя, отпускают стекло. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. На покровное стекло наносят каплю иммерсии и микроскопируют с объективом 90×. Препарат «раздавленная капля» следует немедленно просматривать, так как он быстро высыхает.

Препарат «висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов стерильной петлей наносят на покровное стекло, которое переворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с «лункой» в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят в жидкой питательной среде.

Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой блок и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него пинцетом, снимают и помещают в каплю воды или раствора метиленового синего (1:40) на предметное стекло.

Препараты живых клеток микроорганизмов после завершения работы помещают в дезинфицирующий раствор.

Фиксированные окрашенные препараты

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает несколько этапов: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

Приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю стерильной воды, в которую вносят небольшое количество бактериальной массы стерильной петлей, тщательно перемешивают. Полученную суспензию распределяют тонким слоем по стеклу на площади 1–2 см2.

Высушивание мазка. Приготовленный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе или в струе теплого воздуха высоко над пламенем спиртовки, держа стекло мазком вверх. При этом недопустимо перегревание препарата, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация мазка. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т. е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Фиксацию можно осуществлять двумя путями:

1. Термическая обработка – это наиболее распространенный способ фиксации препарата. Для этого препарат трижды проносят через наиболее горячую часть пламени спиртовки, держа предметное стекло мазком вверх. Метод достаточно грубый, но сохраняет морфологию бактерий и их отношение к окраске.

2. Фиксация химическими веществами. Для более детального изучения структуры клеток применяют фиксирующие растворы, предотвращающие ферментативный аутолиз бактерий. При исследовании препаратов с использованием светооптической микроскопии наиболее часто применяют формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары осмиевой кислоты и др. Мазки фиксируют, помещая их в раствор фиксатора или нанося его на мазок.

Окрашивание мазка. Для окрашивания клеток микроорганизмов используют кислые и основные (щелочные) красители. К кислым красителям относятся те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), - анион. Например, эозин, эритрозин, кислый фуксин и др.; эти красители хорошо связываются с цитоплазматическими компонентами клетки. У основных красителей хромофором является катион, поэтому они интенсивно связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерий делают ее более чувствительной к основным красителям. В связи с этим в микробиологической практике широко применяются основные красители – генциановый фиолетовый, основной фуксин, метиленовый синий, сафранин и др.

Различают простые и дифференциальные способы окрашивания. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видимыми ее форма и размеры. При простом окрашивании препарата удобно использовать модифицированный метод Синева. Для этого фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки, лежащие над кюветой (рис. 9). На мазок помещают фильтровальную бумагу, пропитанную генциан фиолетовым или фуксином, увлажняют ее водой (бумага должна плотно прилегать к стеклу) и окрашивают в течение 3–5 мин. После окраски препарат тщательно промывают водой, высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой. Затем на сухой препарат помещают каплю иммерсионного масла и просматривают под микроскопом с увеличением объектива 90×.

Рис. 9. Кювета с «мостиком» для окрашивания препаратов

При правильном окрашивании поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов.

Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а определенных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества.