Малый практикум по микробиологии (стр. 2 )

В верхней части тубусодержателя находится вращающийся вокруг своей оси револьвер, в отверстия которого ввинчиваются объективы, и гнездо для крепления тубуса. В верхний конец тубуса вставляется окуляр.

Оптическая часть микроскопа включает осветительный аппарат, объектив и окуляр.

Осветительный аппарат состоит из осветителя и конденсора и предназначен для наилучшего освещения препарата. Осветитель составляет неотъемлемую часть микроскопа. В настоящее время в моделях микроскопов «Биолам» предусмотрено устройство для конденсора с встроенным осветителем ОИ-31 или ОИ-32. Конденсор состоит из нескольких линз и предназначен для собирания параллельных лучей света, идущих от источника света. В конденсор вмонтирована ирисовая (апертурная) диафрагма, позволяющая задерживать излишние лучи света и регулировать апертуру (см. ниже) конденсора. Под конденсором находится откидная оправа для светофильтра.

Объектив является наиболее важной частью микроскопа. Он дает действительное увеличенное и обратное изображение изучаемого объекта. Объектив состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Самая главная – наружная (фронтальная) линза, от фокусного расстояния которой зависит увеличение объектива. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Увеличение объектива всегда обозначено на его оправе. Микроскопы имеют «сухие» объективы, дающие увеличение в 8 (10) и 40 раз, и иммерсионные, увеличивающие в 90 (100) раз. От увеличения объектива зависят еще две его характеристики – рабочее расстояние, т. е. расстояние от фронтальной линзы до плоскости препарата при сфокусированном объективе, и площадь поля зрения. Чем больше увеличение объектива, тем меньше его рабочее расстояние и поле зрения (табл. 1).

Таблица 1

Оптические данные объективов микроскопа МБР-1

Система	Собственное увеличение	Числовая апертура	Фокусное расстояние, мм	Свободное рабочее расстояние, мм
Сухая	8×	0,20	18,2	8,53
Сухая	40×	0,65	4,3	0,40
Масляная иммерсия	90×	1,25	1,9	0,10

Выше фронтальной линзы в объективе расположены коррекционные линзы, предназначенные для получения более четкого изображения. Как известно, изображение, получаемое при помощи линз, обладает рядом недостатков – абберацией. Наиболее существенные – сферическая и хроматические абберации. Первая проявляется в невозможности одновременной фокусировки всего поля зрения, вторая связана с разложением белого света на спектр, в результате чего изображение приобретает радужную окраску. Объективы, у которых сферическая и хроматическая аберрация скоррегированы не полностью, называются ахроматами. Они содержат до шести линз и дают изображение наиболее резкое в центре. Более совершенные объективы – апохроматы – состоят из 10, а иногда из 12 линз. Хроматическая погрешность в низ почти в 10 раз меньше, чем у ахроматов. Кроме того, апохроматы обеспечивают более равномерную резкость изображения. На их оправе имеется обозначение «Апохр». Планохроматы полностью устраняют искривление поля зрения, вплоть до краев. Эти объективы применяют при микрофотографировании.

Окуляр содержит две линзы – глазную (верхнюю) и собирательную (нижнюю) и служит для рассмотрения изображения предмета, даваемого объективом, т. е. выполняет роль лупы. Окуляры могут давать увеличение в 5, 7, 10, 12, 15, 20 раз, что указано на их оправе, например, 15×. Общее увеличение окуляра повышается с уменьшением фокусного расстояния составляющих его линз, поэтому более сильные окуляры будут короткими, а более слабые – длинными.

Объектив и окуляр дают изображение объекта, увеличенное в той или иной степени. Общий принцип образования изображения во всех современных световых микроскопах показан на рисунке 2.

Рис. 2. Схема образования изображения в световом микроскопе:

А – объект, О – объектив, Е – окуляр, А’ – изображение объекта А

Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, использование окуляра 15× и объектива 90× позволяет увеличить объект в 1350 раз.

Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа, которая зависит от длины волны используемого света и числовой апертуры оптической системы микроскопа. Теоретически возможный предел разрешения светового микроскопа равен 0,2 мкм. Разрешающая способность связана обратной связью с пределом разрешения d – минимальным расстоянием между двумя точками, при котором еще можно различить каждую из них. Предел разрешения определяется следующим образом:

где d – минимальное расстояние между двумя точками; А1 – числовая апертура объектива, А2 – числовая апертура конденсора; λ – длина волны, используемого света.

Числовая апертура определяется произведением синуса половины (u) отверстного угла (α) на показатель преломления среды (n), граничащей с линзой: А = n × sin u. Иными словами, числовая апертура – это оптический охват линзы, она является мерой количества света, попадающего в линзу (рис. 3).

Рис. 3. Схема хода лучей при разной величине угла u:

А – объект, О – объектив, а – отверстный угол, u – половина отверстного угла

Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом, не может быть больше 1, т. к. показатель преломления воздуха равен 1, а угол (u) не может быть больше 90°. Повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя путями. Либо освещать объект более короткими лучами света, например, ультрафиолетом, что требует применения дорогостоящей кварцевой оптики и соответствующих источников света, ртутных ламп, либо увеличить показатель преломления среды, граничащей с линзой, приблизив его к показателю преломления стекла, на котором находится объект (n стекла = 1,5). Для этого между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом помещают каплю жидкости с показателем преломления, большим, чем показатель преломления воздуха, например, каплю воды (n = 1,3), глицерина (n = 1,4) или кедрового масла (n = 1,5). Для каждой указанной жидкости выпускаются специальные объективы, которые называются иммерсионными. Числовая апертура этих объективов возрастает благодаря увеличению как значения n, так и sin u. Числовая апертура объектива указана на его оправе. У масляного иммерсионного объектива с увеличением 90× апертура составляет 1,25. На оправе этого объектива нанесено также обозначение «МИ» - масляная иммерсия и черное кольцо.

Апертура конденсора должна соответствовать числовой апертуре объектива. Когда она меньше апертуры объектива, оптические возможности линзы последнего не будут использованы полностью из-за слабости попадающего в нее светового потока. Если апертура конденсора больше апертуры объектива (что, в частности бывает при работе с сухими системами), то необходимо несколько прикрыть ирисовую диафрагму конденсора. Это приведет к устранению рассеянного света и даст нужную контрастность изображения.

Правила работы с иммерсионным объективом

1. Препарат (фиксированный окрашенный или «раздавленная капля») помещают на предметный столик и закрепляют клеммами. На препарат наносят каплю иммерсионного масла. Препарат должен быть сухим, чтобы масло не смешалось с жидкостью.

2. Устанавливают иммерсионный объектив 90× и с помощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Эту операцию надо проводить осторожно, следя за тем, чтобы фронтальная линза не коснулась предметного стекла и не получила повреждения.

3. Фокусируют изображение при помощи макрометрического винта.

4. Осуществляют точную фокусировку с помощью микрометрического винта.

5. По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сухой хлопчатобумажной салфеткой.

Задание 1. Просмотреть фиксированные окрашенные препараты бактерий с использованием иммерсионного объектива 90×.

Для микроскопирования рекомендуются фиксированные окрашенные препараты культур Bacillus mesentericus, B. megaterium, B. thuringiensis, Micrococcus luteus, Sarcina flafa и др. Объекты зарисовывают в рабочей тетради, под каждым рисунком приводят название на латинском языке и увеличение микроскопа, при котором рассматривали препарат.

Материалы и оборудование. Микроскоп, иммерсионное масло, фиксированные окрашенные препараты, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага.

Вопросы:

1.  В чем заключаются правила работы в микробиологической лаборатории? Как проводят подготовку микробиологической лаборатории к работе?

2.  Для какой цели служит бокс?

3.  Рассказать об устройстве светового микроскопа.

4.  Для чего служат фронтальная и коррекционные линзы объектива? Что такое абберация? Какие объективы называют ахроматами, апохроматами и планохроматами?

5.  Как определить общее увеличение микроскопа? Что такое разрешающая способность микроскопа?

6.  В чем заключаются правила работы с иммерсионным объективом?

ТЕМА 2. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ОКРАСКИ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Занятие 2

Цель занятия: освоение работы с фазово-контрастным устройством и темнопольным конденсором. Знакомство с принципами работы люминесцентного и электронного микроскопов. Овладение техникой приготовления препарата «раздавленная капля» и фиксированного окрашенного препарата.