Малый практикум по микробиологии (стр. 16 )

По физическому состоянию среды делятся на три группы: жидкие, плотные и сыпучие.

Жидкие среды широко используют для накопления биомассы, для исследования физиологии и биохимии микроорганизмов, для поддержания и сохранения коллекции культур, которые плохо развиваются на плотных средах.

Плотные среды. Для уплотнения сред наиболее часто используют агар-агар. Это сложный полисахарид, состоящий из агарозы и агаропектина. Агар получают из некоторых морских водорослей. В воде он образует гель, который плавится при температуре около 100 °С, а затвердевает при 40 °С. Агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. Агар добавляют к среде в количестве 2 %. Если необходимо получить более влажную среду добавляют 1, а более плотную – 3 % агара. Агаризованные среды нашли широкое применение в микробиологической практике. Их используют для выделения чистых культур, в диагностических целях для описания колоний, для определения количества микроорганизмов, для хранения культур в коллекциях и в ряде других случаев. Плотной основой могут служить пластинки силикагеля, которые пропитывают питательной средой.

Сыпучие среды (пшено, отруби) применят в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных веществ, для наращивания биомассы грибов – продуцентов микоинсектицидных препаратов, для сохранения некоторых культур в коллекциях.

Условия культивирования

Скорость роста микроорганизмов, а также урожай клеток, их жизнеспособность, характер метаболизма, дифференцировка и химический состав зависят от различных физико-химических факторов среды. Наиболее важные из них – рН, температура и содержание кислорода.

рН среды. Кислотность – важный фактор среды, определяющий существование в ней микроорганизмов. рН влияет на ионное состояние веществ, делая их доступными или недоступными для микроорганизмов. У неспециализированных бактерий экстремальные значения рН среды влияют на клеточную стенку и ЦПМ.

Большинство микроорганизмов являются нейтрофилами, для которых оптимальны значения рН, близкие к 7,0. Ацидофилы приспособлены к очень низкой кислотности среды, оптимальными для их развития являются значения рН от 2,0 до 4,0. Алкалофилы растут в щелочных средах, проявляя максимальный рост при рН от 9,0 до 10,5.

В средах, приготовленных для культивирования микроорганизмов, определяют значение рН, используя рН-метр или индикаторы (жидкие или бумажные). В случае необходимости рН среды доводят до нужного значения растворами кислот (HCl, H2SO4), щелочей (NaOH, KOH) или солей, имеющих щелочную реакцию (Na2CO3, Na2HCO3). рН среды может измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и довести до нужного значения, если это требуется, стерильными растворами кислоты или щелочи.

Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начального роста, достаточно часто меняется в процессе культивирования микроорганизмов, что является результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Например, при сбраживании углеводов в среде накапливаются органические кислоты, снижающие рН среды.

Для предотвращения значительных колебаний рН в питательные среды добавляют тот или иной буфер, например фосфатный или бикарбонатный. Буферное действие оказывает также добавленный в среду в виде порошка мел (CaCO3), он поддерживает рН на уровне, близком к нейтральному, даже при сильном кислотообразовании.

Для контроля за изменением показателей рН при росте бактерий (например, как диагностическим признаком) в состав сред вводят индикаторы (слабые органические кислоты или основания, ярко окрашенные в зависимости от протонирования/депротонирования). В качестве таких индикаторов используют бромфеноловый синий, метиловый красный, тимоловый синий. Поддерживать значение рН среды в узком диапазоне позволяют автоматические системы контроля рН, состоящие из рН-электрода, рН-метра, системы регуляции/установки допустимых пределов изменения рН и насоса для добавления кислоты или основания.

Температура. Температурный диапазон, в пределах которого возможен рост микроорганизмов, варьирует у разных видов. У мезофилов, к которым относится большинство микроорганизмов, оптимальная для роста температура лежит в интервале от 25 до 37 °С. Микроорганизмы, входящие в группу термофилов, имеют различные температурные оптимумы – от 45 до 80–105 °С. Психрофилы – холодолюбивые микроорганизмы – хорошо развиваются в интервале температур от 5 до 10 °С. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияет на развитие микроорганизмов, поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая оптимальная температура.

Аэрация. Облигатно аэробные микроорганизмы нуждаются для роста в молекулярном кислороде; для факультативных анаэробов предпочтительны аэробные условия, но они способны расти и в отсутствие кислорода. Микроаэрофилы приспособлены к росту при очень низком содержании кислорода в среде, например, 0,1–0,5 %. Развитие облигатных анаэробов возможно только в отсутствие молекулярного кислорода. Неодинаковые потребности микроорганизмов в свободном кислороде учитывают при выборе способа их выращивания.

Культивирование аэробных микроорганизмов

Для культивирования аэробных микроорганизмов используют поверхностное и глубинное культивирование. В первом случае культуру выращивают на поверхности плотной среды или в тонком слое жидкой среды. При поверхностном культивировании важно увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом, так как кислород поступает в клетки микроорганизмов непосредственно из воздуха. Для улучшения аэрации среды наливают тонким слоем в посуду с широким дном – чашки Петри, колбы Виноградского, матрацы. Растущие в жидких средах аэробные микроорганизмы часто образуют на поверхности пленку, факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще среды. Поверхностное культивирование применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности.

При глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Однако растворимость кислорода в воде невелика, поэтому следует постоянно аэрировать среду. Наиболее распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание культуры на качалках, обеспечивающих встряхивание при вращении колб или пробирок со скоростью 100–200 об/мин и более. Чем больше скорость вращения, тем больше соприкосновение среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. В ферментерах механическое перемешивание среды совмещают с принудительной аэрацией среды, осуществляемой путем продувания стерильного воздуха через толщу среды.

Культивирование анаэробных микроорганизмов

Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложное, так как соприкосновение клеток анаэробов должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено. Для этого используют различные приемы, нередко, комбинируя, их друг с другом.

Выращивание в высоком слое среды – наиболее простой способ ограничения доступа воздуха к клеткам микроорганизмов. Жидкую среду наливают в сосуды для культивирования высоким слоем. Непосредственно перед посевом среду кипятят или прогревают на кипящей водяной бане 30–40 мин., затем быстро охлаждают, чтобы в ней не успел раствориться кислород воздуха, и вносят на дно посевной материал.

Иногда используют метод культивирования в вязких средах. Диффузия кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости, поэтому в вязких средах, таких, как картофельная или среды с кукурузной либо другой мукой, хорошо развиваются некоторые облигатные анаэробы. Вязкость сред можно увеличить добавлением к ним 0,2 – 0,3 % агара.

Для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении их численности анаэробные микроорганизмы выращивают в толще питательной среды. С этой целью посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до 48–50 °С агаризованную среду, тщательно перемешивают и оставляют в пробирках или переливают в заранее простерилизованные трубки Бурри или чашки Петри. Поверхность среды в пробирках заливают стерильным парафином. При использовании чашек Петри для выращивания анаэробов засеянную агаризованную среду наливают в крышку чашки, и после того, как среда застынет, плотно прижимают к ее поверхности дно чашки. Зазор между стенками дна и крышки, где среда соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафином (рис. 39, 40).

Рис. 39. Трубка Бурри:

1 – трубка, подготовленная к стерилизации, 2 – колонии

анаэробных микроорганизмов в толще агаризованной среды

Рис. 40. Культивирование анаэробов в чашке Петри:

1 – агаризованная среда, 2 - парафин

Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах – вакуумных металлических камерах, снабженных монометром. Из анаэростата откачивают воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой смесью, состоящей из азота (90–80 %) и углекислого газа (10–20 %), до давления 67×103 Па (0,7 атм.). Избыточное давление исключает возможность диффузии кислорода воздуха.

Для культивирования анаэробов также используют вакуумный эксикатор, из которого кислород удален в результате его взаимодействия с водородом. Источником водорода служит NaBH4, выделяющий Н2 при низком рН. Этот реагент в виде порошка помещают в эксикатор в отдельной емкости и добавляют к нему воду, после чего камеру закрывают. Образующийся Н2 в присутствии катализатора реагирует с О2 с образованием воды.

Рост многих облигатных анаэробов возможен только в средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (Eh). Поэтому в среды для культивирования анаэробов рекомендуется добавлять восстановители, например, цистеин, тиогликолевую кислоту или ее натриевую соль, сульфид натрия, аскорбиновую кислоту или дитиотреитол. Степень поглощения кислорода и, соответственно, степень восстановленности среды определяется окислительно-восстановительным потенциалом, который измеряют с помощью рН-метра или индикаторов таких, как резазурин, феносафранин и нейтральный красный, изменяющих окраску при изменении Eh.