Малый практикум по микробиологии (стр. 21 )

Приготовление препарата. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бу­магу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 или 6 см2 (либо соответствующий прямоугольник рисуют на нижней стороне предметного стекла). Затем на стекло из микропипетки наносят точно измеренный объ­ем исследуемой суспензии (0,01, 0,02 или 0,03 мл) и каплю 0,03–0,1%-ного водного раствора агара. Нанесенную суспензию равномерно распределяют петлей по площади, отмеченной на миллиметровой бумаге или стекле. Препарат подсушивают на воздухе, фик­сируют 10–20 мин 96°-ным спиртом (или в пламени спиртовки) и окрашивают 1–2 мин фук­сином Циля или любым другим красителем. Краситель сливают, препарат промывают, последовательно погружая стекло в 4–5 стаканов с водой (промывать препарат под струёй водопроводной воды не следует), и высушивают на воздухе. В таком виде препа­раты хорошо сохраняются.

Количество клеток подсчитывают с иммерсионным объекти­вом в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа. Правила подсчета в квадратах окулярной сетки те же, что и при подсчете клеток в квадратах сетки счетной камеры. Чтобы ре­зультат был достоверным, клетки микроорганизмов рекомендует­ся подсчитывать в 50–100 полях зрения. Общее количество под­считанных клеток не должно быть менее 600. Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата, вычисляют по формуле:

,

где М – количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата; а – среднее число клеток в поле зрения (квадрате окулярной сетки); В – площадь квадрата поля зрения (окулярной сетки) в мкм2; V – объем нанесенной на стекло суспензии в мл; S – площадь приготовленного мазка в мкм2; п – разведение исследуемого суб­страта.

Площадь квадрата сетки или поля зрения определяют с по­мощью объект-микрометра. Последний помещают на столик мик­роскопа вместо препарата и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, определяют сторону квадрата окулярной сет­ки или диаметр поля зрения. Площадь поля зрения вы­числяют по формуле s = pr2.

Задание 1. Определить количество клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae в суспензии с помощью счетной камеры Горяева – Тома.

Задание 2. Определить количество клеток палочковидных бактерий Bacillus sereus в суспензии методом Виноградского – Брида.

Материалы и оборудование: предметные стекла, камера Горяева-Тома, бактериологическая петля, пинцет, стерильные пипетки на 1 мл, микропипетки, стерильная вода в пробирках, колба с водой, кристаллизатор, спиртовка, фуксин или генциан фиолетовый, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага, миллиметровая бумага, микроскоп, иммерсионное масло.

Вопросы:

1.  В чем сущность подсчета клеток в камере Горяева-Тома?

2.  В чем преимущество метода Виноградского-Брида?

Тема 11. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ (ПРОДОЛЖЕНИЕ)

Занятие 14

Косвенные методы количественного учета микроорганизмов

Микроорганизмы распространены в природе повсеместно: в почве, водоемах, воздухе, на различных поверхностях, в теле человека и животных и т. д.

Одним из наиболее благоприятных субстратов для развития разнообразных микроорганизмов является почва. Количество микроорганизмов в 1 г почвы исчисляется сотнями миллионов, даже миллиардами клеток. Особенно многочисленны и разнообразны микроорганизмы в ризосфере и на поверхности корней растений. Численность и качественный состав почвенной микрофлоры зависят от типа почвы, ее агротехнической обработки, вида и возраста растений, времени года и др. факторов.

Знание количества микроорганизмов, населяющих почву, а также представителей определенных физиологических групп, необходимы для понимания роли микроорганизмов в природе и процессах почвообразования.

В отличие от прямых косвенный метод дает возможность определить число только жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует, метод дает возможность определить число микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, но не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растут или растут крайне медленно. Это важно помнить при анализе различных естественных субстратов. Поэтому, чтобы выделить и учесть более широкий круг микроорганизмов в определенном субстрате, подбирают среду, на которой способны развиваться микроорганизмы с различными свойствами. Такой питательной средой является МПА (мясо-пептонный агар), на которой развиваются многие гетеротрофные микроорганизмы. При высеве из почвы на МПА вырастают микроорганизмы различных систематических и физиологических групп: грамотрицательные бактерии родов Pseudomonas, Flavobacterium и Achromobacter, грамположительные спорообразующие палочки рода Bacillus, кокки родов Sarcina, Micrococcus, различные микобактерии, некоторые высшие актиномицеты (род Actinomyces) и мицелиальные грибы (род Aspergillus, Penicillium, Trichoderma и др.).

Для выявления и учета количества микроорганизмов физиологических и систематических групп используют чашечный метод Коха (высев на плотные питательные среды) и метод предельных разведений (высев в жидкие питательные среды).

Наиболее распространенный способ количественного учета микроорганизмов – метод Коха.

Метод применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного учета микроорганизмов, проведенного методом Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных единицах КОЕ (колониеобразующих единицах). Данный метод позволяет также оценить разнообразие микроорганизмов по морфологии колоний.

Определение количества клеток микроорганизмов в почве методом Коха

Отбор почвенных образцов. Почва неоднородна по химическому и физическому составу; эта гетерогенность почвы сказывается и на распределении микроорганизмов в почвенном слое, что следует учитывать при отборе проб для микробиологических анализов.

Для отбора почвенных образцов используются металлический совок, нож, лопата, иногда почвенный бур. Эти предметы перед взятием каждой пробы хорошо очищаются, обтираются смоченным спиртом ватным тампоном и прожигаются в пламени. Предварительно стерильным инструментом снимается и отбрасывается верхний слой почвы (около 2 см), после чего почва отбирается в стерильные мешочки или чашки Петри по 100 – 200 г.

Для микробиологического анализа часто используют среднюю пробу, отбирая образцы из разных мест опытного участка и смешивая их. С каждой площадки размером 25 м2 отбирают 10 проб в шахматном порядке или рядами по диагонали на определенной глубине, например 2 – 10 см, 10 – 20 см от поверхности. Если берут почву на разной глубине, то выкапывают яму, поверхность стенки ямы срезают стерильным ножом (лопатой) и стерильным инструментом берут пробу из определенного горизонта.

После взятия проб почвы в асептических условиях микробиологический анализ проводится не позднее, чем через 24 часа, т. к. при более длительном хранении почвенных образцов происходят значительные изменения в составе микробных сообществ. До анализа и между определениями пробы хранят в холодильнике.

При взятии пробы в специальной тетради делают соответствующую запись, где отмечают: дату отбора пробы, место отбора; общее описание участка (характер рельефа и растительности); описание почвенного профиля и характера почвы; глубину взятия пробы, метеорологические данные.

Подготовка почвенного образца к анализу. Пробу почвы высыпают на стерильное сухое стекло, тщательно перемешивают стерильным шпателем. При помощи стерильного пинцета удаляют корешки и другие посторонние включения. Навеску почвы в количестве 10 г переносят в колбу на 250 мл со 100 мл стерильной водопроводной воды, взбалтывают 10-15 мин и дают отстояться грубым частицам в течение 1 мин. При этом учитывают, что в полученной исходной суспензии исследуемый материал (почва) разведен в 10 раз (10-1).

Значительно больше микроорганизмов выявляется, если навеску почвы предварительно поместить в стерильную фарфоровую чашку и увлажнить стерильной водой (0,4 – 0,8 мл) до пастообразного состояния. Смесь растирают 5 мин стерильным пестиком или пальцем в стерильной резиновой перчатке. При этом разрушаются почвенные агрегаты и происходит десорбция микроорганизмов с поверхности почвенных частиц. Растертую массу смывают в стерильную колбу на 250 мл стерильной водой (100мл) около пламени горелки. Колбу встряхивают в течение 5 – 10 мин, суспензии дают отстояться и используют для дальнейших целей.

Определение числа микроорганизмов включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

Приготовление разведений

Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или 0,85%-ном растворе NaCl. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.

Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды – это 1-е разведение, 10-1 (рис. 53). Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем той же пипеткой отбирают один мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку – получают 2-е разведение (10-2). Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов: чем выше плотность популяции, тем больше разведение.