Малый практикум по микробиологии (стр. 20 )

Рис. 50. Форма разжижения желатины:

1 – послойное, 2 –реповидное, 3 – кратерообразное,

4 – мешковидное, 5 – пузыревидное, 6 - воронкообразное

Протеолиз казеина. При протеолизе казеина (белок молока) наблюдается «просветвление» молока, называемое пептонизацией.

Восстановление нитратов. Для обнаружения в среде нитритов проводят реакцию с реактивом Грисса, которая основана на образовании в кислой среде в присутствии нитритов и ароматических аминов (сульфаниловой кислоты и α-нафтиламина) азосоединения, окрашенного в красно-розовый цвет.

Для выполнения реакции в фарфоровую чашечку вносят каплю реактива Грисса, а затем каплю культуры. Появление красного окрашивания свидетельствует о присутствии нитритов.

Отношение к молекулярному кислороду. Анализируют характер роста культуры по уколу в среде Гисса. Строгие аэробы растут на поверхности среды и в верхнем слое, микроаэрофилы – на некотором расстоянии от поверхности. Факультативные анаэробы обычно развиваются по всей толще среды. Строгие анаэробы растут только в глубине среды у самого дна пробирки (рис. 51).

Рис. 51. Рост микроорганизмов при посеве уколом:

1 – аэробы, 2 – микроаэрофилы, 3 – факультативные анаэробы, 4 - анаэробы

Задание 3. Определить исследуемую культуру до рода.

Для определения культуры до рода использовать следующие определители:

1.  Определитель бактерий Берджи: В 2 т. Пер. с англ. под ред. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. – М.: Мир, 1997. – Т. 1. – 432 с.; Т. 2. – 368 с.

2.  Красильников бактерий и актиномицетов / . – М.-Л.: Изд-во Академии Наук СССР, 1949. – 825 с.

Материалы и оборудование. Чашки Петри и пробирки с посевами, лупа, реактив Грисса, пипетки на 1 мл, фарфоровые чашки, Определитель бактерий Берджи (1997), Определитель бактерий и актиномицетов (Красильников, 1949).

Вопросы:

1.  По какой схеме ведется описание колоний?

2.  По каким параметрам описывают характер роста культуры в МПБ?

3.  При помощи какой реакции можно обнаружить нитриты в среде?

4.  Каким образом определяют отношение культуры к молекулярному кислороду?

5.  Какие определители бактерий знаете? Каков принцип расположения материала в «Определителе бактерий Берджи»?

Задание на дом

Написать отчет по теме «Идентификация бактерий» по плану:

1. Морфологические и тинкториальные признаки исследуемого штамма бактерий (форма и размеры клеток, тип соединения клеток, наличие подвижности, образование спор, тип спорообразования, расположение спор в клетке, окраска по Граму).

2. Культуральные свойства исследуемого штамма (описание колонии на РПА, характер роста в МПБ).

3. Физиолого-биохимические свойства идентифицируемой бактерии (использование углеводов, образование аммиака и сероводорода, продуцирование протеолитических ферментов (коллагеназы и казеиназы), восстановление нитратов, отношение к кислороду).

4. Систематическое положение идентифицируемого штамма.

5. На основании полученных данных оформить паспорт культуры:

П А С П О Р Т

штамма микроорганизма

1. Видовое название культуры:

2. Номер и наименование штамма:

3. Культурально-морфологические особенности штамма:

Морфология клеток:

Окраска по Граму:

Подвижность:

Наличие спор:

Тип спорообразования:

Морфология колоний (на РПА):

Морфология роста по штриху (РПА):

Рост в МПБ:

4. Физиолого-биохимические свойства штамма:

Протеолитическая активность:

разжижение желатины ___________

пептонизация молока ____________

Образование продуктов обмена:

аммиак _____________

сероводород _________

Восстановление нитратов:

Ферментация сахаров:

Отношение к кислороду:

Дата заполнения:

Тема 11. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ

(Занятия 13–15)

Цель занятий 13–15: освоить прямые и косвенные методы количественного учета микроорганизмов. Определить количество клеток микроорганизмов в образце почвы высевом на плотные питательные среды. Изучить морфологические и культуральные свойства выделенных микроорганизмов.

О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по количеству их клеток или биомассе в единице объема. Чтобы определить общее количество микроорганизмов в различных субстратах, выявить и учесть численность представителей отдельных групп и видов микроорганизмов, применяют ряд методов. Методы определения этих показателей могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание на весах) или косвенными. Косвенные методы основаны на измере­нии параметров, величина которых зависит от количества или био­массы микроорганизмов (число колоний, выросших после высева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглоще­ние суспензией клеток света, содержание в ней белка и др.). Вы­бор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Так, многие методы, используемые для опреде­ления числа одноклеточных микроорганизмов, не приемлемы при подсчете многоклеточных (нитчатых, мицелиальных и др.) форм.

При оценке численности микроорганизмов, особенно в естест­венных субстратах (прежде всего в почве), необходимо помнить, что их клетки часто находятся в прикрепленном (адгезированном) состоянии или в виде микроколоний. Поэтому перед началом под­счета их нужно отделить от частиц субстрата и друг от друга (десорбировать). Выбор метода десорбции (механическое переме­шивание суспензии клеток, растирание, обработка ультразвуком, применение поверхностно активных веществ и т. д.) определяется особенностями исследуемого субстрата.

Занятие 13

Прямые методы количественного учета микроорганизмов

Методы прямого счета под микроскопом позволяют определить общее количество клеток в единице объе­ма, так как подсчитываются все живые и мертвые клетки. Однако эти методы не позволяют судить о том, какие процессы микроорганизмы осуществляют в данном субстрате.

Подсчитать клетки микроорганизмов под микроскопом можно, используя счетные камеры, капилляры Перфильева, препараты фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на пред­метных стеклах или мембранных фильтрах. Основное ограничение большинства указанных методов — необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

Подсчет клеток в счетных камерах. Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов—дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относитель­но крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева - Тома, хотя можно при­менять и другие счетные каме­ры. Камера Горяева представля­ет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квад­рата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и со­ответствует 1/25 мм2 (большой квадрат) или 1/400 мм2 (малый квадрат). Часть предметного стекла, на которой нанесена сет­ка, на 0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры; она всегда указывается на предмет­ном стекле (рис. 52).

Рис. 52. Счетная камера Горяева – Тома:

А – вид сверху, Б – вид сбоку, В – при малом увеличении микроскопа

Приготовление препарата. При работе с камерой необ­ходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные сто­роны до появления колец Нью­тона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сто­ронам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. Пос­ле этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов, которую вносят через бороздку камеры пипеткой или капилляром. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3–5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5%-ном водном растворе формалина.

Число клеток подсчитывают с объективом 8× или 40×. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитыва­ют клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересе­кающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете коли­чество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.

Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток повторяют 3–4 раза, каждый раз монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

,

где М – число клеток в 1 мл суспензии; а – среднее число клеток в квадрате сетки; h – высота камеры в мм; S – площадь квадрата сетки в мм2; 103 – коэффициент перевода см3 в мм3; n - разведение исследуемой суспензии.

Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (ме­тод Виноградского-Брида). Метод широко используется для оп­ределения численности микроорганизмов в различных естествен­ных субстратах – почве, загрязненных водах, молоке, в оптически непрозрачных питательных средах, содержащих нерастворимые в воде компоненты, например, крахмал, соевую муку. Преиму­щество метода заключается в возможности учитывать клетки микроорганизмов меньших размеров, так как для подсчета используют иммерсионный объектив 90×, а также в том, что фиксированные ок­рашенные препараты хорошо сохраняются, поэтому подсчет мож­но проводить в удобное для исследователя время.