Малый практикум по микробиологии (стр. 5 )

Фиксированные окрашенные препараты используют для изучения морфологических особенностей клеток бактерий. В отличие от препаратов живых клеток фиксированные препараты могут долго храниться.

Электронная микроскопия

Просвечивающая электронная микроскопия

Первый просвечивающий электронный микроскоп был сконструирован в 1931 году Руска, а в 1939 г. Сименс создал просвечивающий микроскоп, получивший широкое распространение. В просвечивающем (трансмиссионном) электронном микроскопе (ТЭМ) вместо светового излучения используют пучки ускоренных электронов, обладающих волновыми свойствами, причем эквивалентная длина волны таких пучков на несколько порядков меньше световой, что обуславливает высокую разрешающую способность электронных микроскопов этого типа. В электронном микроскопе с напряжением 100000 В длина волны электрона равна 0,004 нм, согласно теории разрешение такого микроскопа составляет 0,002 нм. Однако коррекция аберрации электронных линз – задача более сложная, чем для стеклянных линз, и поэтому в реальности разрешение современных электронных микроскопов составляет 0,1 нм. Для биологических объектов разрешение составляет 2 нм, что связано с трудностями приготовления образца. На сверхтонких монокристаллических пленках достигается разрешение 0,1 нм.

Основной частью ТЭМ является вакуумная колонна (электронно-оптическая система), в которой последовательно, сверху вниз, расположены и точно съюстированы относительно общей оси симметрии (оптической оси):

·  Электронная пушка с катодом и анодом, обеспечивающая эмиссию и ускорение электронов;

·  две конденсорные магнитные линзы, управляющие диаметром электронного пучка;

·  объектный столик;

·  три или четыре магнитные линзы, формирующие увеличенное изображение;

·  вспомогательные устройства (дефлекторы и стигматоры) для точной юстировки системы;

·  люминесцирующий экран для наблюдения увеличенного изображения;

·  фотокамера.

В вакуумной колонне с помощью вакуум-насосов создается глубокий вакуум для предотвращения рассеяния электронов (вследствие их сталкивания с молекулами воздуха) и обеспечения условий работы накаленного катода. Источником электронов является катод. Катод – это вольфрамовая нить, накаливаемая электрическим током до высокой температуры, при которой возникает электронная эмиссия. Между катодом и анодом (металлическим диском с отверстием в центре, расположенным под катодом) подается высокое ускоряющее напряжение (50 – 100 кВ), благодаря чему пучок ускоренных электронов направляется вниз, в сторону образца. При этом электронный луч, сфокусированный конденсорными магнитными линзами, направляется на образец. Часть электронов в момент прохождения через образец рассеивается согласно плотности вещества в данном участке, остаток электронов фокусируется и образует изображение на люминесцирующем экране.

Подготовка образцов для исследования в ТЭМ. В электронном микроскопе образцы подвергаются действию вакуума высокой степени разрежения и поэтому их невозможно наблюдать в живом влажном состоянии. Биологические объекты должны быть зафиксированы и обезвожены, а для повышения контрастности изображения обработаны соединениями тяжелых металлов.

Фиксацию осуществляют с помощью обработки объекта растворами глутаральдегида и четырехокиси осмия (OsO4). Глутаральдегид ковалентно связывает белковые молекулы между собой, четырехокись осмия стабилизирует двойной слой липидов и белки. Во время фиксации наибольшее количество осмия поглощается фосфолипидными мембранами и жировыми включениями, которые за счет этого приобретают способность сильно рассеивать ускоренные электроны.

Для обезвоживания применяют водные растворы этанола возрастающих концентраций.

Оттенение. На высушенный образец напыляется тонкая пленка тяжелого металла, например, хрома или платины. Металл напыляется под определенным углом, так что отложения напыленной пленки в некоторых местах толще, чем в других. Этот процесс называется оттенение, так как возникает эффект тени, создающий впечатление трехмерности изображения.

Ультратонкие срезы готовят с помощью ультрамикротомов, используя стеклянные или алмазные ножи. Срезы помещают на медные (в особых случаях на никелевые или золотые), мелкоячеистые сетки диаметром 3 мм, предварительно покрытые тонкими пленками-подложками из специальных полимеров – поливинилформаля или поливинилбутираля, проводят контрастирование. Изучение срезов клеток дает возможность выявить множество деталей внутреннего строения микроорганизмов.

Сканирующая электронная микроскопия

В основу сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) положен принцип формирования изображения на экране электронно-лучевой трубки с помощью развертки, синхронной с разверткой электронного луча, последовательно облучающего сканируемую поверхность изучаемого объекта. При этом одновременно регистрируется ряд вторичных излучений, что обеспечивает высокую информативность и разрешаемую способность метода СЭМ, с помощью которого изучаются морфология и структура поверхности различных объектов. Очень важно изучение рельефа поверхности отдельных клеток микроорганизмов, архитектоники расположения клеток в колониях, конгломератах. Предельное разрешение в сканирующем электронном микроскопе достигает порядка 10 нм при использовании вольфрамового термокатода и порядка 5 нм со специальными электронными пушками повышенной яркости.

При использовании традиционных сканирующих электронных микроскопов объект должен быть зафиксирован, обезвожен и высушен с помощью методов, щадящих его поверхность. Используют химическую фиксацию (глутаровым альдегидом, четырехокисью осмия). Обезвоживание – обязательный этап, если не используют низковакуумные СЭМ. Обезвоживание существенно ослабляет действие сил поверхностного натяжения на границе раздела жидкость – воздух и тем самым предохраняет поверхность-мишень от деформации этими силами при высушивании. Высушивание необходимо для последующей подготовки объекта к исследованию в СЭМ в условиях высокого вакуума. Оно должно обеспечить удаление всех жидких компонентов из образца. Этот этап может привести к нарушению сохранности поверхности объекта, поэтому образцы высушивают щадящим их поверхность методом высушивания в критической точке (ВКТ). Метод ВКТ основан на переходе жидкости, пропитывающий образец, в газообразное состояние сразу по всему объему, а не испарение с поверхности, как при высушивании на воздухе. Высушивание объектов возможно и после быстрого глубокого замораживания в условиях, когда не успевают образоваться крупные кристаллы льда, разрушающие поверхность (например, в жидком азоте в присутствии криопротекторов – этанола, ацетона).

После высушивания образцы прикрепляют к специальным немагнитным объектным столикам. Наиболее удобно прикреплять к объектному столику образцы, фиксированные на покровных стеклах.

Последний этап подготовки к исследованию поверхности образцов – нанесение на них сверхтонкой (не более 20 нм) пленки сплавов золото/палладий или платина/палладий. Для этого используют метод вакуумного испарения или метод ионного распыления.

Также используют методы, основанные на получении механических реплик: «замораживание – скалывание» и «замораживание – травление». Метод «замораживание – скалывание» дает возможность изучить внутреннее строение клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота (-196 °С) в присутствии криопротекторов во избежание искажений за счет образования кристаллов льда. Замороженный блок затем раскалывают. Скол часто проходит через гидрофобную середину двойного слоя липидов, обнажая внутреннюю поверхность клеточных мембран. Образующуюся поверхность скола оттеняют платиной, органический материал удаляют и изучают полученные реплики в электронном микроскопе.

Метод «замораживание – травление» используется для изучения внешней поверхности клеток и мембран. Метод заключается в том, что клетки замораживают при очень низкой температуре и замороженный блок раскалывают. Содержание льда вокруг клеток (и в меньшей степени внутри клеток) понижают возгонкой воды в вакууме при повышении температуре (вакуумная сушка).

Задание 1. Установить фазово-контрастное устройство. Приготовить препарат «раздавленная капля», используя односуточную культуру Bacillus thuringiensis, и просмотреть с фазовым объективом 90× и соответствующей диафрагмой фазово-контрастного конденсора. Обратить внимание на изменение контрастности изображения. Отметить тип спорообразования. Зарисовать микроскопическую картину.

Задание 2. Установить темнопольный конденсор. Приготовить препарат «раздавленная капля», используя односуточную культуру Bacillus thuringiensis, просмотреть с объективом 90×.

Материалы и оборудование. Микроскоп, фазово-контрастное устройство КФ-4; темнопольный конденсор ОИ-13, иммерсионное масло, спиртовка, предметные и покровные стекла, бактериологическая петля, пинцет, стерильная вода в пробирках, стерильные пипетки на 1 мл, кристаллизатор, колба с водой, генциан фиолетовый, фуксин, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага, дезинфицирующий раствор.

Демонстрация: люминесцентный микроскоп МБД-1, электронный микроскоп BS-540 («TESLA», Чехословакия).

Вопросы:

1.  В чем сущность методов фазово-контрастной микроскопии и микроскопии в темном поле?

2.  Каков принцип работы люминесцентного микроскопа? Преимущества данного вида микроскопии?

3.  Какие препараты живых клеток знаете? Методы их приготовления.

4.  Из каких этапов складывается приготовление фиксированного окрашенного препарата? Какие красители используют в микробиологической практике?

5.  Принцип устройства и работы просвечивающего электронного микроскопа. В чем заключается подготовка образцов для исследования в ТЭМ? Как готовят ультратонкие срезы?

6.  Принцип работы сканирующего электронного микроскопа. Как готовят препараты для сканирующей электронной микроскопии?

7.  Рассказать о методах «замораживание – скалывание» и «замораживание – травление».