Малый практикум по микробиологии (стр. 9 )

Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные и покровные стекла, спиртовка, бактериологическая петля, пинцет, стерильная вода в пробирках, стерильные пипетки на 1 мл, кристаллизатор, колба с водой, генциан фиолетовый, фуксин, раствор Люголя, стаканчики с 96°-ным спиртом, анилиновый черный, тушь, иммерсионное масло, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага, дезинфицирующий раствор.

Вопросы:

1.  Основные отличия клеточной организации прокариот и эукариот?

2.  Структура, химический состав и функции компонентов прокариотной клетки.

3.  В чем заключаются отличия в строении и химическом составе клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий?

4.  В чем сущность метода окраски бактерий по Граму?

5.  Что представляют собой капсулы, слизистые слои и чехлы? Каковы их функции?

6.  В чем заключается сущность метода «негативного контрастирования» для выявления капсул?

7.  Какое значение имеют кристаллы δ-эндотоксина для бактерий вида Bacillus thuringiensis? Какой способ окраски используют для обнаружения кристаллов δ-эндотоксина?

ТЕМА 4. МОРФОЛОГИЧЕСКИ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ КЛЕТКИ ПРОКАРИОТ

Занятие 4

Цель занятия: познакомиться с морфологически дифференцированными клетками прокариот.

К морфологически дифференцированным клеткам прокариот относятся:

1. Структуры, служащие для переживания неблагоприятных условий (покоящиеся формы) – эндоспоры ряда грамположительных бактерий, цисты азотобактера и миксобактерий, акинеты цианобактерий, экзоспоры отдельных представителей метилотрофных и фототрофных бактерий, экзо - и эндоспоры актиномицетов.

2. Морфологически дифференцированные клетки, служащие для размножения – гормогонии и баеоцисты цианобактерий.

3. Структуры, связанные с осуществлением процесса азотфиксации – гетероцисты цианобактерий и бактероиды клубеньковых бактерий.

Бактериальные эндоспоры – это особый тип покоящихся клеток в основном грамположительных бактерий, формирующихся эндогенно, обладающих специфическими структурами, (многослойными белковыми покровами, наружной и внутренней мембранами, кортексом) и устойчивостью к высоким температурам и дозам радиации, летальным в норме для вегетативных клеток. Споры образуются при неблагоприятных условиях среды. Патогенные формы образуют споры вне организма хозяина. Образование эндоспор – процесс, имеющий место только в мире прокариот.

Спорообразование характерно для бактерий родов Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Desulfotomaculum и актиномицетов рода Thermoactinomyces. В настоящее время обнаружены грамотрицательные спорообразующие бактерии. Например, Sporomusa и представители сем. Haloanaeroibaceae. В каждой бактериальной клетке образуется, как правило, одна спора.

Цикл спорообразующих бактерий включает две стадии:

1.  вегетативные клетки – размножающаяся стадия;

2.  споры – неразмножающаяся переживающаяся стадия.

Строение и химический состав бактериальной эндоспоры. В зрелой споре различимы центральный, плохо окрашиваемый участок (спороплазма) и оболочка споры, состоящая из внутренней, наружной мембраны и кортекса. У некоторых видов имеется экзоспориум (рис. 18).

1

 

7

6

5

4

3

2

Рис. 18. Строение эндоспоры прокариот:

1 – нуклеоид, 2 – цитоплазма, 3 – внутренняя мембрана споры, 4 – наружная мембрана

споры, 5 – кортекс, 6 – покровы споры, состоящие из нескольких слоев, 7 – экзоспориум

(по Дуде, Пронину, 1981)

Спорообразование сопровождается активным синтезом белка. Белки эндоспор в отличие от белков вегетативных клеток богаты цистеином и гидрофобными аминокислотами, с чем связывают устойчивость спор к действию неблагоприятных факторов. Содержание ДНК в споре несколько ниже, чем в исходной вегетативной клетке. Генетический материал поступает в спору в виде полностью реплицированных молекул ДНК. Споры некоторых видов содержат по 2 или 3 копии хромосомы. Содержание РНК в спорах ниже, чем в вегетативных клетках. Для спор характерно повышенное содержание ионов Са2+ и появление дипиколиновой кислоты. Эти соединения образуют комплекс, локализованный в сердцевине споры. Помимо Са2+ в эндоспорах обнаружено повышенное содержание других катионов (Mg2+, Mn2+, K+), с которыми связывают пребывание спор в состоянии покоя и их термоустойчивость. Споры находятся в крайне обезвоженном состоянии.

Экзоспориум состоит из липидов и белков. Выполняет функцию дополнительного барьера, защищающего спору от внешних воздействий, а также регулирующего проникновение в нее различных веществ. Механическое удаление экзоспориума не приводит к какому-либо повреждению спор.

Споровые покровы в основном состоят из белков, в небольшом количестве содержат липиды и гликолипиды. Белки покровов обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным воздействиям и обеспечивают спорам защиту от действия литических ферментов, других повреждающих факторов, а также предохраняют спору от преждевременного прорастания.

Кортекс построен, в основном, из молекул особого типа пептидогликана. При прорастании споры из части кортекса, прилегающего к внутренней споровой мембране, формируется клеточная стенка вегетативной клетки.

Эндоспоры отличаются от вегетативных форм репрессией генов и почти полным отсутствием обмена веществ. От степени снижения метаболической активности зависит длительность сохранения жизнеспособности покоящихся клеток.

Для эндоспор характерна устойчивость к высоким и низким температурам, обезвоживанию, высокой кислотности среды, радиации, к механическим воздействиям и т. д. Зрелые споры хорошо выдерживают нагревание до 80 °С, что позволяет дифференцировать спорообразующие бактерии от неспорообразующих. В виде спор бактерии могут длительное время сохраняться (до 1000 лет).

Инактивация спор может быть достигнута автоклавированием, прогреванием в аэростериле при температуре 160–170 °С в течение 60–120 мин., действием спороцидных химических веществ.

В оптимальных условиях прорастание эндоспоры осуществляется в течение 2–3 часов. Активации споры способствует пятиминутное прогревание водной суспензии спор при 60 °С. Прорастание начинается с интенсивного поглощения спорой воды и ее набухания. На первом этапе происходит активация ферментов, резко возрастает дыхание, из спор удаляется дипиколиновая кислота, идет активный синтез белка и РНК. Репликация ДНК начинается через 1–2 часа после начала прорастания споры. Последующие этапы состоят в разрушении кортекса, разрыве споровых покровов, выходе ростовой трубки, достраивании ею клеточной стенки и последующем делении сформированной вегетативной клетки.

Задание 1. Окрасить споры по методу Пешкова.

Для окраски спор целесообразно использовать 7-ми суточную культуру Bacillus mesentericus, Bacillus megaterium или Bacillus thuringiensis.

Эндоспоры обладают многослойными труднопроницаемыми оболочками, поэтому при простом окрашивании препарата спорообразующих бактерий фуксином или генциан фиолетовым споры не окрашиваются. В этом случае они обнаруживаются в виде бесцветных включений; свободные споры имеют вид колец.

Окраска спор по методу Пешкова состоит в следующем:

1. На обезжиренном предметном стекле готовят мазок, высушивают и фиксируют в пламени спиртовки.

2. Мазок заливают раствором метиленового синего по Леффлеру. Краситель доводят до кипения, держа предметное стекло пинцетом над пламенем спиртовки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента закипания, – 10–20 сек.

3. Затем предметное стекло охлаждают, препарат тщательно промывают водой, и докрашивают в течение 30 сек. 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного. После этого краситель сливают, препарат промывают водой и просматривают под микроскопом, используя иммерсионный объективом 90×.

При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры – синий цвет.

Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные стекла, спиртовка, бактериологическая петля, пинцет, стерильная вода в пробирках, стерильные пипетки на 1 мл, колба с водой, раствор метиленового синего по Леффлеру, 0,5%-ный водный раствор нейтрального красного, иммерсионное масло, кристаллизатор, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага, дезинфицирующий раствор.

Вопросы:

1.  Какие группы морфологически дифференцированных клеток прокариот знаете?

2.  Что такое бактериальные эндоспоры? Какие стадии включает цикл спорообразующих бактерий? Строение и химических состав бактериальных эндоспор?

3.  Этапы формирования эндоспоры спорообразующими бактериями?

4.  С чем связывают устойчивость эндоспор к неблагоприятным факторам внешней среды?

5.  Какими способами можно инактивировать эндоспоры?

6.  Как осуществляется прорастание эндоспор?

7.  В чем заключается сущность метода окраски спор по методу Пешкова?

ТЕМА 5. МОРФОЛОГИЯ ПРОКАРИОТ

Занятие 5

Цель занятия: познакомиться с морфологией прокариот.

Величина клеток различных прокариот варьирует. В среднем линейные размеры их клеток лежат в пределах 0,5–3 мкм. Но среди бактерий есть свои «карлики» и «гиганты». Так, некоторые спирохеты достигают длины 500 мкм. Самые мелкие из известных бактерий – микоплазмы, среди них описаны организмы с диаметром 0,1–0,15 мкм. Основная масса прокариот – одноклеточные организмы. Постоянство формы клеток прокариот обеспечивается наличием клеточной стенки. Клетки большинства прокариот имеют сферическую, палочковидную или спиралевидную форму.