Малый практикум по микробиологии (стр. 8 )

У некоторых грамположительных бактерий (микобактерий, нокардий и коринебактерий) 30 % вещества клеточной стенки приходится на липиды – миколовые кислоты и воска.

Наружный покров клеточной стенки грамположительных бактерий состоит из нейтральных полисахаридов или белка.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий отличается сложным строением (рис. 15, 16). Особенностью клеточной стенки грамотрицательных бактерий является наличие наружной мембраны. В электронном микроскопе на срезах она выглядит как волнистый слой. Наружная мембрана состоит из фосфолипидного бислоя, белков, полисахаридов, липопротеинов и липополисахарида. Липополисахарид – специфический компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, локализован во внешнем слое наружной мембраны и является антигеном. В наружной мембране находятся белки-порины, которые образуют в ней каналы для переноса малых молекул, а также белки-переносчики и белки-рецепторы.

Рис. 16. А. Клеточная стенка грамотрицательных эубактерий:

1 – цитоплазматическая мембрана; 2 – пептидогликановый слой; 3 – периплазматическое пространство; 4 – молекулы белков (заштрихована гидрофобная часть); 5 – фосфолипид; 6 – липополисахарид.

Б. Строение молекулы липополисахарида:

1– липид А; 2 – внутреннее полисахаридное ядро; 3 – наружное полисахаридное ядро; 4 – О-антиген

Между ЦПМ и наружной мембраной находится периплазматическое пространство (периплазма), в котором располагается слой пептидогликана. У грамотрицательных бактерий в клеточной стенке содержится от 1 до 10 % пептидогликана. В периплазматическом пространстве также находятся белки, олигосахариды, неорганические молекулы. Транспортные белки переносят субстраты из внешней среды, от наружной мембраны к ЦПМ. В периплазме локализованы гидролитические ферменты (протеазы, липазы и т. д.).

Функции клеточной стенки прокариот:

1.  Придает клеткам определенную форму.

2.  Является механическим и осмотическим барьером.

3.  Выполняет транспортную функцию.

4.  На поверхности клеточной стенки располагаются рецепторы для бактериофагов и бактериоцинов, антигены.

5.  Содержит аутолизины – ферменты, растворяющие пептидогликан, что необходимо для процессов роста клеточной стенки и споруляции.

Поверхностные структуры клетки

Капсулы, слизистые слои и чехлы

Капсула – это слизистое образование, обволакивающее клетку, имеющее аморфное строение и сохраняющее связь с ней, располагается поверх клеточной стенки. Клетки могут утрачивать капсулу, сохраняя жизнеспособность. Различают микрокапсулы и макрокапсулы. Микрокапсула имеет толщину меньше 0,2 мкм, просматривается только под электронным микроскопом. Макрокапсула имеет толщину больше 0,2 мкм, выявляется методом негативного контрастирования.

Большинство капсул состоят из полисахаридов и воды, у стрептококков из белка, у некоторых бацилл из полипептидов (полиглутаминовой кислоты), у некоторых бактерий в состав капсулы входит целлюлоза. Капсульный материал связан с компонентами клеточной стенки ионными или ковалентными связями. Капсулы имеются у патогенных и непатогенных бактерий. У патогенных бактерий капсула являются фактором патогенности.

Слизистые слои – это клеточные выделения, имеют аморфное строение, бесструктурны, легко отделяются от клетки. При выращивании в жидкой среде могут легко отделяться от клетки. У роящихся клеток (Myxococcus xanthus), окружающая их слизь служит матриксом, способствующим передвижению колонии.

Чехлы имеют тонкую структуру, нередко в них обнаруживается несколько слоев с разным строением. Встречаются у нитчатых бактерий. Состоят из гетерополисахарида. Чехол представляет собой полую трубку, заключающую в себе цепочку бактериальных клеток.

Между всеми этими структурами много переходных форм. Капсулы, слизистые вещества и чехлы выполняют определенные полезные для клетки функции. Они защищают клетку от механических повреждений, высыхания, создают дополнительный осмотический барьер, препятствую проникновению фагов. С помощью слизи осуществляется контакт между клетками в колонии. Капсулы способствуют адгезии бактерий. Иногда слизистые вещества могут служить источником запасных питательных веществ.

Жгутики и микроворсинки

Жгутики имеются у подвижных бактерий. Жгутик состоит из длинной спиральной нити – фибриллы, крюка и базального тела. Фибрилла имеет длину 12–20 мкм, толщину – 10–20 нм, состоит из белка флагеллина. Белковые субъединицы уложены в виде спирали, внутри которой проходит полый канал. Снаружи жгутик может быть покрыт чехлом. Жгутик при помощи крюка крепится к базальному телу. Крюк состоит из белка и обеспечивает гибкое соединение нити с базальным телом.

Базальное тело вмонтировано в ЦПМ и клеточную стенку. Содержит 11 типов белков и состоит из системы колец. У грамположительных имеется М - и S-кольцо. М-кольцо находится в ЦПМ, S - – в пептидогликановом слое клеточной стенки. У грамотрицательных базальное тело включает 4 кольца. М-кольцо локализовано в ЦПМ; S - – в периплазматическом пространстве; Р - – в пептидогликановом слое; L - – в наружной мембране.

Базальное тело функционирует как мотор жгутика по типу корабельного винта. Предполагают, что вращение жгутика определятся вращением М-кольца. Р - и L-кольца выполняют роль подшипники, т. е. неподвижны, служат для крепления жгутика, у грамположительных эту функцию выполняет пептидогликановый слой. Движущей силой вращения служит протонный градиент (энергия трансмембранного электронного потенциала). При вращении колец их движение сообщается связанной с ним жгутиковой нити. Жгутики при движении собираются в пучок, вращаясь в одном направлении, это вращение передается клетке, которая начинает вращаться в другом направлении, что обеспечивает эффективное плавание в жидкой среде и более медленное перемещение по поверхности плотной среде. Скорость передвижения Vibrio cholerae в жидкой среде при помощи единственного жгутика составляет 12 мм/мин; Bacillus mesentericus – 1,6 мм/мин. Биосинтез жгутиков регулируется геномом клетки.

Микроворсинки (фимбрии, пили) располагаются по поверхности клетки. Их количество составляет от нескольких единиц до нескольких тысяч на клетку. Микроворсинки имеются у подвижных и неподвижных форм. Они начинаются на цитоплазматической мембране и пронизывают клеточную стенку, представляют собой нитевидные клеточные придатки диаметром 3–10 нм, варьирующие по длине (0,2–2 мкм). Микроворсинки построены из белка пилина, белковые субъединицы которого формируют полую спираль. Различают обыкновенные пили и F-пили.

Обыкновенные пили или пили общего типа обеспечивают прикрепление бактерий к субстрату, участвуют в транспорте метаболитов. За счет пили увеличивается площадь бактериальной клетки, что дает ей преимущество в утилизации питательных веществ из окружающей среды. Через ворсинки могут проникать фаги.

F-пили (фактор фертильности) участвуют в конъюгации бактерий. Имеют вид полых белковых трубочек длиной 0,5–10 мкм, их образование кодируется плазмидами. Между клеткой-донором и клеткой-реципиентом образуют конъюгационный тоннель, по которому происходит передача ДНК.

Задание 1. Окрасить бактерии по Граму, руководствуясь следующей методикой:

1. На предметном обезжиренном стекле готовят три мазка: в центре мазок исследуемой культуры, слева и справа – мазки контрольных культур. В качестве контрольных культур используют грамположительные (например, Sarcina flafa, Bacillus mesentericus) и грамотрицательные бактерии (например, Pseudomonas putida, Escherichia coli) (рис. 17).

Рис. 127. Схема приготовления препарата при окраске по Граму:

1 – мазок грамположительных бакте­рий; 2 – мазок грамотрицательных бактерий; 3 – исследуемая куль­тура

2. Приготовленные мазки высушивают на воздухе или над пламенем спиртовки.

3. Фиксируют мазки, используя термическую обработку, т. е. проносят препарат через наиболее горячую часть пламени спиртовки трижды, держа предметное стекло мазком вверх.

4. Окрашивают мазки в течение 1–2 мин. генциан фиолетовым.

5. Не промывая мазок водой, обрабатывают в течение 1–2 мин. раствором Люголя до почернения.

6. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 96°-ным спиртом в течение 0,5-1 мин., погружая предметное стекло в стаканчик со спиртом до полного отхождения фиолетовых струй. Грамположительные бактерии не обесцвечиваются в спирте и остаются окрашенными в фиолетовый цвет, грамотрицательные обесцвечиваются.

7. Препарат промывают водой и дополнительно окрашивают в течение -1–2 мин. фуксином. Затем препарат вновь промывают водой, высушивают и просматривают под микроскопом, используя иммерсионный объективом с увеличением 90×.

При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные – розово-красный цвет.

Задание 2. Выявить капсулы у исследуемой культуры.

Для выявления капсул используют метод «негативного контрастирования». Для этого небольшое количество клеток культуры помещают в каплю разбавленного фуксина на предметное стекло и смешивают с каплей туши. Затем препарат закрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом, используя иммерсионным объектив 90×. При этом на общем темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки бактерий, окрашенных в розовый цвет.

Задание 3. Обнаружить кристаллы δ-эндотоксина в клетках Bacillus thuringiensis.

Для этого готовят мазок 7-ми суточной культуры B. thuringiensis, высушивают, фиксируют над пламенем спиртовки и в течение 2 мин. окрашивают анилиновым черным. Затем осторожно смывают краску водой и докрашивают мазок фуксином в течение 15 секунд фуксином. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионным объективом (с увеличением 90×). При правильной окраске белковые кристаллы окрашиваются в черный, а клетки – в розовый цвет.