Лекционный курс по частной вирусологии Вирусы вызывающие болезни жвачных и однокопытных (стр. 6 )

Выделить вирус из носовой полости, влагалища и с конъюнктивы удается с 5-го по 10-й дн, а ВНА - с 5-8-го дня после заражения. Более высокий титр AT наблюдается после 35 дн, затем начинается медленное снижение. Для выделения вируса ИРТ из бразильской спермы использовали 2 линии перевиваемых клеток МДВК и метод непрямой ИФ (67). Установле­но, что максимальное количество вируса выделяется во время подъема температуры тела на 4-7-й дн болезни и продолжался до 10-14 дн.

Индикация вируса

Обнаружение специфических телец-включений. В ядрах клеток эпителия поражен­ных слизистых оболочек носовой полости, вульвы, вагины и конъюнктивы находят специ­фические тельца-включения. Через 18-20 ч после заражения их можно обнаружить в клет­ках культуры, окрашенной гематоксилин-эозином.

Выделение вируса. Вирус выделяют в культурах клеток почек телят, почек эмбрионов телят, тестикул бычков. В настоящее время для выделения вируса ИРТ используют 2 линии клеток МДВК. В этой линии клеток выделяли вирус из бразильской коммерческой спермы с признаками ЦПЭ и подтверждением методом прямой ИФ.

Экспресс-методы индикации. Для обнаружения вируса ИРТ применен метод молекулярной гибридизации с использованием радиоак­тивно меченых ДНК-зондов. Однако более перспективным является применение нерадиоак­тивного метода детекции вирусной ДНК. Описаны выявленные последовательности BHV-1 гибридизацией in situ с помощью меченного биотином ДНК-зонда. Предложенный зонд также имел существенный недостаток, поскольку неспецифически связывался с ДНК вируса БА. Поэтому разработан нерадиоактивный метод детекции вируса ИРТ на основе высокочувствительного зонда, меченного биотином. Время тестирования биотинилированного зонда составляет около суток, что существенно меньше по сравнению с вирусологиче­ским тестированием (до 40 дн). Наиболее важным представляется использование биотинилированного ДНК-зонда в случае выявления вируса в период карантинирования вновь заве­зенных животных, а также для обнаружения заболевания на ранних стадиях и диагностики латентной формы ИРТ для выявления возможного содержания вируса ИРТ в сперме быков. Разработана также ПЦР для обнаружения герпесвируса типа 1 КРС.

Серологическая идентификация.

ИФ. Техника постановки её такая же, как и при диагностике аденовирусной инфекции КРС. Обращают внимание на свечение АГ в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповреж­денных клеток. Ярко-зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цито­плазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Пред­варительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от об­щего количества исследованных проб. В мазках из влагалища и конъюнктивы специфиче­скую флюоресценцию отмечали через 24 ч, из препуция - через 48, из носа и трахеи - через 72 ч после заражения. Присутствие специфического АГ удается подтвердить заражением культуры клеток почки телят, в которой обнаруживается специфическая перинуклеарная и диффузная цитоплазматическая флюоресценция, свойственная ИРТ. Использование культу­ры клеток почки кролика позволяет освободиться от неспецифического свечения. Совпадаемость результатов ИФ и патологоанатомических изменений составляет 87%, а ИФ и вирусологических исследований - 44%. При параллельном исследовании сывороток в РН и РИГА результаты совпадали в 94% случаев. В полевых условиях РИФ оказалась поло­жительной в 18,5%, а метод вирусовыделения - в 15,9% случаев. РИФ можно использовать для экспресс-диагностики ИРТ с последующим подтверждением диагноза вирусологически­ми методами.

РН. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной ИФ проводят окончательное типирование вируса в РН, которую ставят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК. Результаты РН учиты­вают по ЦПД вируса, для чего определяют титр типируемого изолята в присутствии специ­фической и отрицательной контрольной сывороток. Титр рассчитывают по методу Рида и Менча и выражают в ТЦДзо/мл. Затем вычисляют индекс нейтрализации. Видовую принад­лежность изолята устанавливают при разности в титрах вируса не менее 2 lg; при разности от 1 до 2 реакцию считают сомнительной, в этом случае её повторяют; при разности нейтрализации менее 1 реакцию считают отрицательной. При положительных ре­зультатах РН изолят считают идентифицированным.

РТГА. Ставят её микрометодом при 4°С с 0,5-1%-ной взвесью эритроцитов белых мы­шей, разбавитель - трис-буферный р-р с 0,2% БСА. В качестве АГ используют культуральную жидкость, которую концентрируют ПЭГ-6000 или ультрацентрифугированием.

ELISA. Иммунопероксидазный метод можно использовать для исследования прижиз­ненно взятых нозофарингиальных мазков-отпечатков в клетках, полученных из носовых смывов. Кроме того, для лабораторной идентификации вируса ИРГ рекомендован непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод НАИП. При световой микроскопии он обеспечивает четкое выявление вирусного АГ в цитоплазме инфицированных клеток в виде окрашенных в коричневый цвет образований, которые видны при увеличении в 140 раз. Специфичность показателей, полученных этим методом, подтверждается постановкой специальных иммунологических контролей. При постановке перекрестной иммунопероксидазной реакции с гетерологичными АГ эта реакция имеет выраженный видоспецифический характер: АГ реагирует только с гомологичной сывороткой. Эндогенная пероксидаза в куль­туре клеток ПЭК и LF не выявляется.

Таким образом, НАИП является перспективным при диагностике острых респиратор­ных вирусных инфекций КРС. При использовании его для индикации вируса ИРТ в культуре клеток ПЭК АГ выявляется через 18-22 ч после заражения. Три прямых серологических метода быстрого обнаружения вирусных АГ (ИФ, ИФА и ELISA) одинаково приме­нимы для обнаружения вируса во время лихорадки, но не на поздних стадиях болезни.

Идентификация с помощью монАТ антител. Иммунопероксидазный метод с исполь­зованием монАТ является более чувствительным и специфичным по сравнению с обычными методами выделения вируса. Помимо того, данный метод имеет преимущество в быстроте получения результатов. Быстрое подтверждение вируса ИРГ (инфекции) возможно ме­тодом культивирования его с последующим ИФА зараженной культуры с использованием монАТ. Проведена молекулярная характеристика южноамериканских изолятов герпес-вируса-1 (ИРГ) КРС с помощью монАТ и электрофореза в полиакриламидном геле с доде-цилсульфатом натрия.

Идентификация посредством рестрикционного анализа ДНК. Описаны методы клонирования фрагментов генома вируса ИРТ, выделение и характеристика рекомбинантного ДНК-зонда, которые позволяют определять вирус в клинических пробах. С помощью метода дот-блот-гибридизации выявлена ДНК вируса ИРГ в пробах спермы, полученной от серопозитивных животных, когда выде­ление вируса в культуре клеток давало отрицательный результат. Хороший результат также получен при использовании инфицированных культур клеток.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. AT к вирусу ИРТ можно обнару­жить в сыворотках крови больных и переболевших животных в РН, РНГА и др. Для поста­новки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток, взятые с интерва­лом в 3 нед. Результат серодиагностики учитывают по возрастанию титра AT в парных про­бах сыворотки, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал.

РН. Ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса в культуре клеток ПЭК или ТБ. Вирус предварительно титруют в культуре клеток. Заражен­ные и контрольные культуры инкубируют при 37°С, ежедневно учитывая ЦПД вируса, окончательный учет проводят на 5-7-е сут. Наибольшей чувствительностью обладает РН, основанная на 24-ч инкубации смеси вирус-сыворотка. Титром вируса считают об­ратную величину его наибольшего разведения, вызывающего ЦПД в 50% культур, который высчитывают по методу Рида и Менча, или Кербера и выражают в ТЦДзо/мл. Титры 1:32, 1.64 обнаруживаются редко. В неблагополучных по данной болезни стадах ВНА выявляют­ся у 12% клинически здорового скота. Ретроспективный диагноз на ИРТ ставят при 4-кратном и более приросте AT в пробах сывороток реконвалесцентов. В настоящее время широко используют микрометод РН.

РНГА. Биологическая промышленность нашей страны выпускает эритроцитарный диагностикум. РНГА ставят согласно методическим указаниям в микропанелях с U-образными лунками наборов микротитрования Такачи или Титертек по общепринятой методике. Ре­зультаты РНГА с используемыми сыворотками оценивают по титрам; положительные - 1:16 и выше, сомнительные - 1:8, отрицательные - 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титров AT в парных сыворотках в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции. Применяя РНГА, можно обнаружить AT в более ранний период инфекции, чем с помощью РН. Установлено соответствие результатов РНГА и РН в 95% случаев. Высокие титры чаще выявляли в РНГА. С её помощью быстрее, чем РН проводить тонирование AT к вирусу ИРТ. Титры AT были в 7-10 раз выше выявляемых в РН.

РДП. Не нашла широкого применения в диагностической практике, хотя многие иссле­дователи рекомендуют её использовать для серодиагностики ИРТ. Marchang (1982) считает, что диагностика по наличию ПА имеет ряд преимуществ по сравнению с РН: она проще и быстрее в постановке, чем РН. ПА обнаруживают вскоре после введения вируса в организм, но они быстро исчезают. По наличию ПА можно уловить недавно прошедшую инфекцию, в то время как ВНА длительно циркулируют в организме, и заболевание можно уловить только по парным сывороткам. При выявлении ПА лучше всего брать пробы крови на 8-й и последующие дни болезни.

РТГА. Может использоваться для выявления и количественной оценки AT к вирусу ИРТ. Титр анти-ГА коррелирует с титром ВНА. Положительный результат РТГА уже в 1-ом разведении сыворотки (1:4) указывает на наличие AT к вирусу ИРГ в данной пробе сыворотки. 4-кратный и более прирост титров анти-ГА в парных пробах сыворотки является показателем активной инфекции.

ELISA. Широко применяют в Нидерландах, США, Великобритании, Швеции, странах бывшего СССР. Он оказался пригодным для обнаружения AT к вирусу ИРТ в молоке. Для этого достаточно получения проб смешанного молока от 5-10 коров. AT определяют после предварительного концентрирования в них Ig. Совпадаемость данных серологических реак­ций в пробах сыворотки крови и молока составляла 92,8%. С помощью метода можно оперативно определять иммунологический статус поголовья лактирующих коров це­лого региона, а также проводить обследование экспортируемых и импортируемых животных.