Определение маркеров аутоиммунных заболеваний (по данным иммунологической лаборатории ККБ№1) (стр. 5 )

– Вынимали слайд из инкубационной камеры, промывали его в стакане с фосфатным буфером.

– Просушивали край слайда фильтровальной бумагой. Помещали слайд обратно в инкубационную камеру, затем из флакона с капельницей отмеряли 1 каплю конъюгата в каждую лунку.

– Инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.

– Вынимали слайд из инкубационной камеры, погружали в стакан, наполненный фосфатным буфером, для удаления избытка конъюгата. Просушивали край слайда фильтровальной бумагой.

– В каждую лунку отмеряли каплю заключающей среды..

– Помещали на слайд покровное стекло.

– Осматривали слайд на наличие специфической флуоресценции с использованием люминесцентного микроскопа.

Слайды анализировали в течение 24 суток после приготовления. Готовые слайды хранились в темноте при температуре 2–8 °С.

2.3 Определения антител к нативной ДНК методом НИФ

Для определения антител к нативной ДНК использовали набор «Anti-native DNA (nDNA) Antibody Test» (ImmuGlo Diagnostics, США).

Антитела к нативной ДНК специфичны для системной красной волчанки, а также встречаются у пациентов страдающих ревматоидным артритом, склеродермией и другими аутоиммунными заболеваниями.

В данном наборе в качестве антигенного субстрата использовались клетки Crithidia luciliae, имеющие кинетопласт – органеллу, содержащую кольцевую ДНК, которая при положительном результате теста окрашивается в яркий яблочно–зеленый цвет.

Процедура анализа в точности соответствует схеме анализа определения антинуклеарных антител.

2.4 Учет результатов иммунофлуоресцентного исследования

Оценка результатов определения антинуклеарных антител (АНА) методом непрямой иммунофлуоресценции проводилась с указанием максимального конечного титра обнаружения АНА в исследуемых сыворотках, а также интенсивности и типа иммунофлуоресценции. Согласно международным рекомендациям, нормальные титры АНА в сыворотке крови составляют менее 1:160. На HEp–2 клетках возможно гомогенное, периферическое, крапчатое, ядрышковое или центромерное окрашивание. Ядрышковое окрашивание может быть как однотипным, так и комбинированным.

При тестировании на антитела к нативной ДНК оценивалось специфическое окрашивание только в тех полях зрения, которые содержали хорошо разделенные клетки Crithidia luciliae. Учитывалось, что специфическое окрашивание кинетопластов. Окрашивание ядер или полярного тела не интерпретировалось как положительный результат анализа на антитела к нативной ДНК. Образцы, у которых отсутствовало специфическое окрашивание кинетопластов, считались отрицательными по антителам к нативной ДНК.

Для анализа слайдов использовался люминесцентный микроскоп для клинической лабораторной диагностики МИКМЕД–2 фирмы «Ломо», г. Санкт–Петербург.

Результаты теста на определение специфических антител класса G к циклическому цитруллинированному пептиду (Anti–CCP) в человеческой сыворотке были получены в иммунологической ИФА–лаборатории с использованием тест–системы «DIASTAT Anti–CCP», США.

Ревматоидный фактор определялся в биохимической лаборатории с помощью автоматического биохимического анализатора Advia1650 (Siemens, Германия) и набора реагентов «AdviaChemistry», Великобритания.

3 Определение маркеров аутоиммунных заболеваний (по данным иммунологической лаборатории ККБ№1)

В ходе иммунологических исследований были проведены тесты по определению различных маркеров системной красной волчанки, ревматоидного артрита и ювенильного ревматоидного артрита у пациентов ККБ№1, поликлиники, ДККБ (Детская краевая клиническая больница) и ДГКБ№1  (Детская городская клиническая больница №1).

Вакуэтты с кровью из различных отделений ККБ№1, поликлиники, ДККБ и ДГКБ№1 поступали в иммунологическую лабораторию ежедневно. После прохождения процедуры центрифугирования из вакуэт отбиралась сыворотка. Приготовление препаратов для анализа методом НИФ осуществлялось с помощью люминесцентной микроскопии.

За период исследований (май – декабрь 2014 г.) в иммунологической лаборатории обследовано 354 образца с предположительным диагнозом СКВ, 110 образцов – с РА, 311 образцов – с ЮРА.

Иммунологическая диагностика системной красной волчанки включает в себя:

– определение в сыворотке крови антинуклеарных антител;

– обнаружение антител к нативной ДНК в сыворотке пациента.

Оба диагностических показателя являются основными маркерами СКВ.

Диагноз системная красная волчанка ставился пациентам при одновременном выявлении высоких титров (1:160) антинуклеарных антител с гомогенным или гранулярным типом свечения и обнаружении антител к нДНК в сыворотке крови. Сомнительными считались пробы, у которых нельзя было точно определить тип свечения при высоких титрах антинуклеарных антител и высоком содержании антител к нативной ДНК.

Из 354 пациентов с предварительным диагнозом системная красная волчанка, 34 человека находились на стационарном лечении в отделении ревматологии, 309 являлись пациентами поликлиники, 11 – пациенты ДККБ. Возраст пациентов варьировал от  9 до 80 лет. Количество женщин более чем в 8 раз превышало количество мужчин,  315 и 39 соответственно.

Встречаемость СКВ у мужчин и женщин за период исследований представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Встречаемость СКВ среди пациентов ККБ№1, поликлиники и ДККБ за май – декабрь 2014 года

Показатели	Мужчины	Женщины	Дети	Всего
Общее количество образцов	39	304	11	354
Количество положительных результатов	9	58	1	68
% положительных результатов	23,1	19,1	9,1	19,2
Количество сомнительных результатов	1	32	1	34
% сомнительных результатов	2,6	10,5	9,1	9,6

Из таблицы 1 видно, что несмотря на то, что количество женщин почти в 8 раз превышало количество мужчин, частота выявления СКВ выше у мужчин и составляет 23,1 % от всех анализов, взятых у мужчин. Сомнительных результатов было поставлено больше у женщин – 10,5 % от всех анализов, взятых у женщин.

Среди детей было выявлено по одному положительному и сомнительному результату.

По данным [2013] женщины страдают СКВ в 8–15 раз чаще мужчин. По полученным нами данным среди женщин больными СКВ оказались 58, а среди мужчин – 9, т. е. больных женщин было выявлено в 6 раз больше, чем мужчин (рисунок 1).

 

Рисунок 1 – Относительная частота выявления СКВ у мужчин, женщин и детей за период исследования в иммунологической лаборатории ККБ№1

Распределение положительных, отрицательных и сомнительных результатов среди пациентов стационарного отделения ККБ№1, поликлиники и ДККБ представлено на рисунке 2.

Рисунок 2 – Соотношение полученных результатов у пациентов стационарного отделения ККБ№1, поликлиники и ДККБ

Общее число проб пациентов из поликлиники значительно превышало число проб пациентов из стационарного отделения ККБ№1 и ДККБ. Из рисунка 2 видно, что число положительных, отрицательных и сомнительных результатов среди пациентов поликлиники также оказалось выше, но если рассмотреть частоту выявления СКВ на рисунке 3, то можно увидеть, что различия незначительные.

Рисунок 3 – Частота выявления СКВ у пациентов стационарного отделения ККБ№1, поликлиники и ДККБ

Из рисунка 3 можно сделать вывод о том, что частота выявления СКВ у пациентов поликлиники выше, чем у пациентов стационарного отделения ККБ№1 и ДККБ. Также из рисунка 3 видно, что СКВ у детей встречается значительно реже – 1 положительный результат (9,1 % от всех обследованных детей).

Исследованиям подвергались пробы пациентов различных возрастов. Нами были выделены четыре возрастные категории пациентов: до 20 лет,  21–40, 41–60, 61–80 лет. Наименьшее число больных находились в возрастной категории 61–80, а наибольшее число положительных результатов выявлено у пациентов в возрасте от 21 года до 40 лет. Распределение мужчин и женщин с положительным результатом по возрастным категориям наглядно отображено на рисунке 4.

Рисунок 4 – Распределение мужчин и женщин с положительным результатом по возрастным категориям

Из рисунка 4 видно, что наибольшее число больных, как мужчин так и женщин, находились в возрастной категории 21–40 лет. Среди мужчин не было выявлено больных младше 20 лет. Среди детей положительный результат был получен у девочки 11 лет.

По данным, приведенным [2002] до 80 % больных СКВ находятся в возрасте до 40 лет. По результатам нашего исследования в возрасте до 40 лет было 66,2 % больных. Около 1/3 женщин с СКВ старше 40 лет. Таким образом, наши данные подтверждают сведения приведенные в литературе.

Пациенты, чьи пробы подвергались исследованиям, являются жителями различных населенных пунктов: 38 районов и 9 городов. Из 354 обследованных диагноз подтвердился у 68 человек (19,2 %) и у 34 пациентов (9,6 %) результат исследования  был признан сомнительным.

Положительные результаты были обнаружены у пациентов из 29 районов и 6 городов. Сомнительные результаты были выявлены у жителей 16 районов и 3 городов.

Встречаемость СКВ у пациентов стационарного отделения ККБ№1, поликлиники и ДККБ из разных населенных пунктов за май – декабрь 2014 г. представлена в таблице 2.

Таблица 2 – Встречаемость СКВ у пациентов из разных населенных пунктов за май – декабрь 2014 года