«Клинико-морфологические особенности и нарушения местных иммунных реакций при гнездной алопеции с учетом стадий активности заболевания»

На правах рукописи

«КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И НАРУШЕНИЯ МЕСТНЫХ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ ПРИ ГНЕЗДНОЙ АЛОПЕЦИИ С УЧЕТОМ СТАДИЙ АКТИВНОСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ»

14.01.10. – «Кожные и венерические болезни»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета имени Минздравсоцразвития России.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Николай Николаевич Потекаев

Доктор медицинских наук, профессор Евгения Алтаровна Коган

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Ирина Марковна Корсунская

Доктор медицинских наук, профессор Антон Владимирович Молочков

Ведущая организация:

Российский Университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «____» ____________2011 г. в ____ часов на заседании Диссертационного 208.040.10.при ГОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета им. Минздравсоцразвития России Москва, ул. Трубецкая, дом 8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ Первого Московского государственного медицинского университета им. ( Москва, Нахимовский проспект)

Автореферат разослан “ ”___________201_ г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д. 208.040.10

Доктор медицинских наук, профессор Светлана Ильинична Эрдес

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время проблема изучения этиологии и патогенеза гнездной алопеции (ГА), а также разработка надежных и эффективных средств лечения по-прежнему сохраняет свою актуальность и научно – практическую значимость. В последние годы отмечается рост числа больных ГА, преимущественно трудоспособного возраста, с увеличением частоты тяжелых и торпидно протекающих форм заболевания [ А, 2002; Shapiro J., Madani S., 1999]. Несмотря на то, что ГА считается относительно доброкачественным заболеванием, выпадение волос создает значительные косметические неудобства для пациентов, что может привести к глубоким изменениям в психо-эмоциональном статусе, вплоть до тяжелых невротических расстройств и формирования патологической личности [, 1992; , , 2001; Gupta M. A., Gupta A. K., 1998; Garcia-Hernandez M. J, 2000].

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

В последнее десятилетие установлены факты, свидетельствующие о важности иммунных нарушений в патогенезе ГА. Полученные к настоящему времени данные о механизмах развития ГА свидетельствуют о том, что в основе патогенеза этого заболевания лежат клеточно-опосредованные местные иммунные реакции, обусловленные генетическими факторами и экзогенными тригеррами. Предполагается, что они связаны с Т-лимфоцитами (CD 8+ и CD 4+) и изменениями цитокинового профиля при действии IL-2, IFN-γ, TNF-a и других провоспалительных цитокинов.

В клинике ГА отмечают стадии, последовательно сменяющие друг друга. В активной стадии характерно усиленное выпадение волос с расширением границ очага облысения и возможностью определения патогномоничных признаков заболевания (волосы в виде восклицательного знака, положительная проба при ручной эпиляции волос, возможное изменение цвета кожи в очаге поражения, зона расшатанных волос). Хроническая или стационарная стадия характеризуется наличием сформированного очага облысения, когда расширения границ не происходит, но рост волос в очаге отсутствует. При благоприятном течении болезни в случае спонтанной ремиссии или в результате успешной терапии наступает следующая фаза – регрессирующая (или восстановительная), во время которой наблюдается повторное отрастание волос.

При гистологическом и иммуногистохимическом исследовании (ИГХ) в очагах ГА определяют неспецифический воспалительный инфильтрат вокруг волосяных фолликулов (ВФ). Литературные данные, относящиеся к описанию патоморфологической картины ГА, недостаточно полно освещают характер распределения клеток инфильтрата и их иммунный фенотип, поскольку не учитывают фазу болезни. Развитие воспалительной реакции в области ВФ, морфофункциональная перестройка тканей с последующим изменением их структуры и другие нарушения, приводящие к потере волос, обуславливают необходимость детального изучения местных иммунных нарушений при ГА с учетом активности заболевания.

Для лечения ГА имеется значительное количество средств и методик, направленных на основные звенья патогенеза заболевания. Однако при назначении этих препаратов не всегда учитываются гистологические особенности ГА, клеточный состав воспалительного инфильтрата и его изменения в зависимости от активности заболевания и в процессе лечения.

В этой связи морфологическое и ИГХ исследование ВФ, клеточного состава перибульбарного и интраэпителиального инфильтрата и распределения провоспалительных цитокинов при разной степени активности заболевания, проводимые с целью применения рационального и патогенетически обоснованного лечения ГА, представляются актуальными.

Цель исследования: изучить патогенез ГА на основании клинико-морфологических и ИГХ особенностей заболевания с учётом остроты патологического процесса.

Для осуществления цели были поставлены следующие задачи:

Изучить клинические и клинико-морфологические особенности ГА при разной стадии активности патологического процесса; Изучить ИГХ особенности местных иммунных реакций в очагах ГА на основе распределения CD4+, CD8+ и CD68+ клеток, а также продукции провоспалительных цитокинов IL-2, TFN-a, IFN-g в биоптатах кожи больных ГА с учётом стадий активности заболевания; Выявить корреляцию между клинико-морфологическими особенностями ГА и эффективностью гормональной противовоспалительной терапии.

Научная новизна исследования:

Впервые детально изучены иммуноморфологические и ИГХ особенности ГА с учетом активности заболевания на основе локализации воспалительного инфильтрата вокруг сосудов, вокруг волосяных фолликулов и внутрифолликулярно и особенностей его клеточного состава и цитокинового профиля.

Установлено, что местные иммунные нарушения имеют различные характеристики в зависимости от активности патологического процесса и сочетаются с клиническими проявлениями заболевания. Данные морфологический и ИГХ-исследований отражают смену воспалительной реакции в активную стадию ГА на репаративные и склеротические процессы в хроническую стадию с преобладанием перифолликулярного и периваскулярного склероза.

Исследование продемонстрировало преимущественный аутоиммунный характер воспаления с развитием РГЧ-IV типа при участии цитотоксических Т-лимфоцитов, которые доминируют среди клеток воспалительного инфильтрата. Цитотоксический эффект при ГА осуществляется за счет кооперации цитотоксических Т-лимфоцитов (CD 8+) c Т-хелперами (CD 4+) и гистиоцитами, и гиперпродукции провоспалительных Th-1 цитокинов (IL-2, IFN-γ и TNF-a). Полученные данные подтвердили необходимость назначения патогенетического лечения с учетом фазы патологического процесса и ИГХ особенностей воспалительного инфильтрата.

Практическая значимость

Решение поставленных задач позволяет детально изучить иммуноморфологические и иммуногистохимические особенности гнездной алопеции (ГА) с учетом активности заболевания на основе локализации воспалительного инфильтрата и особенностей его клеточного состава и цитокинового профиля. Исследование показало, что диагностика и лечение ГА должны базироваться на данных клинико-морфологического и ИГХ-исследования с оценкой клеточного состава воспалительного инфильтрата и уровня продукции клетками провоспалительных цитокинов.

Положения, выносимые на защиту

1. Клинико-морфологические особенности ГА характеризуются развитием местной тканевой воспалительной реакции вокруг ВФ и сосудов в активной стадии и уменьшением воспаления с развитием склеротических и репаративных изменений в хронической стадии заболевания.

2. По результатам ИГХ-исследований в формировании воспалительных реакций в очагах ГА основную роль играют CD8+, CD4+, CD68+ Т-лимфоциты и провоспалительные Th-1 цитокины IL-2, IFN-γ и TNF-a; их распределение и соотношение в клетках воспалительного инфильтрата и ВФ изменяется в зависимости от активности заболевания.

3. Эффективность гормональной противовоспалительной терапии зависит от стадии активности, продолжительности заболевания и частоты рецидивов, что обусловлено характером местных иммуноморфологических изменений в очагах ГА.

Внедрение результатов исследования

Материалы диссертации используются в практической работе КВКД № 1 и КВД № 15 г. Москвы, внедрены в учебный процесс кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ, кафедры патологической анатомии лечебного факультета Первого МГМУ им. .

Апробация диссертации

Диссертация апробирована на заседании кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ Первого МГМУ им. 8 апреля 2011.

Материалы и основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на совместных научно-практических конференциях и заседаниях кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ Первого МГМУ им. , на IX Межрегиональной научно-практической конференции с всероссийским и международным участием «Дальневосточная осень – 2010» (2010, Владивосток), на II и III Международных форумах медицины и красоты (ноябрь 2009, декабрь 2010, Москва).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Все клинические наблюдения, методы исследования освоены автором и большинство из них выполнялись им лично. Составление программы исследования, клиническое обследование и лечение больных, набор, подготовка морфологического материала, патоморфологические и ИГХ исследования биопсийного материала проводились при личном участии автора. Проведена оценка результатов лечения с учетом клинической картины гнездной алопеции и ИГХ особенностей воспалительного инфильтрата. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и клинико-морфологической реализации до проведения анализа, статистической обработки и интерпретации полученных данных, обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и внедрения их в практику.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 4 опубликовано в рецензируемых российских журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. В работе использованы 11 таблиц, 41 рисунок и фотографии. Библиография представлена 257 источниками, из них 56 отечественные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В исследовании приняли участие 54 больных с клиническим диагнозом ГА. Больные находились на амбулаторном лечении в МЛПУ «Лобненская центральная городская больница» и в кожно-венерологическом диспансере № 15 города Москвы.

Обследовались пациенты с жалобами на выпадение волос на голове и развитие полного или частичного облысения. Методы клинико-лабораторной диагностики соответствовали единому плану, который предусматривал общий осмотр больного, общепринятые лабораторные анализы (общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови - АСТ, АЛТ, глюкоза, общий билирубин, общий белок, холестерин), по показаниям – исследование щитовидной железы, консультацию смежных специалистов, биопсию кожи скальпа. Пациент включался в исследование при наличии одиночных или множественных очагов облысения на коже скальпа, либо при полном отсутствии волос на голове и/или других участках кожного покрова. Пациенты исключались из исследования, если в результате комплексного клинико-инструментального обследования, включающего клинический осмотр и гистологическое исследование биопсийного материала, клинический диагноз ГА вызывал сомнения.

Возраст больных составлял от 18 до 56 лет, средний возраст 29 лет, из них 18 мужчин (»33%) и 38 женщин (»66%), т. е. приблизительно 1: 3 соответственно. Контрольную группу составили 10 здоровых доноров: 2 мужчин и 8 женщин, в возрасте от 24 до 47 лет. Средний возраст составил 32 года.

При наружном осмотре у больных с ГА определяли локализацию очагов и их количество. Степень потери волос у больных оценивалась с применением критериев измерения показателей тяжести гнездной алопеции на скальпе S0 – S5, предложенных Olsen et Canfield (1999).

По клиническим формам с учетом критериев измерения показателей тяжести, больные ГА распределялись следующим образом:

1. Легкая форма – локальное выпадение волос: S1– 19 человек (35%);

2. Средняя степень тяжести – клинические формы в виде субтотальной алопеции, включая офиазис: S2-S4 а - 14 человек (26%);

3. Тяжелая форма – потеря волос 96-99% (S4b), тотальная (100% отсутствие волос на волосистой части головы) и универсальная алопеция (100% отсутствие волос на голове, лице и туловище - Sчеловек (39%).

У всех пациентов был собран детальный анамнез заболевания (дебют заболевания, характер течения болезни, количество и продолжительность эпизодов и ремиссий, возможная связь заболевания с предшествующей патологией, проведенное лечение). При сборе анамнеза пациента и семейного анамнеза учитывались: наличие атопии, сопутствующая аутоиммунная патология, синдром Дауна, иммунодефициты и другие ассоциируемые заболевания.

Дебют заболевания ГА варьировал в широких возрастных пределах, от 2 до 49 лет. Средний возраст начала ГА составил 14,5 лет.

Продолжительность заболевания составляла от 3-4 недель до 20 лет в зависимости от тяжести заболевания и активности патологического процесса (табл. 1).

Таблица 1

Продолжительность ГА у больных с разной степенью тяжести заболевания

Продолжительность заболевания	Степень тяжести	Всего
легкая	среднетяжелая	тяжелая
<3 мес.	7	5		12
3-6 мес.	2	1		3
6-12 мес.	1		1	2
12-24 мес.	1	1	3	5
2-5 лет	3	3	7	13
>5 лет	5	4	10	19

На основании клинико-анамнестических данных и объективного осмотра все пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от степени активности заболевания. Пациенты с активной стадией патологического процесса составляли 17 человек (31%) из них легкая степень тяжести отмечена у 11 больных (65%), средняя степень тяжести – у 6 больных (35%). Хроническая стадия заболевания констатирована у 37 человек (69%), из них легкая степень тяжести была у 8 больных (21,5%), средняя степень тяжести – у 8 больных (21,5%), и у всех 21 больных с тяжелой степенью тяжести ГА (57%).

С учетом клинической формы, активности заболевания, наличия сопутствующей патологии внутри каждой группы пациентов с легкой среднетяжелой и тяжелой формами ГА были выделены подгруппы по виду проводимой терапии.

Группа пациентов с легкой степенью тяжести патологического процесса (S1) получали лечение глюкокортикоидом (дипроспан в/к из расчета одной инъекции на курс).

Пациенты с тяжелым течением заболевания (S4b - S5) получали системную терапию глюкокортикоидом преднизолоном внутрь по стандартной схеме: по 35 мг/сут (у пациентов с массой тела менее 60 кг) или по 40 мг/сут - 1 нед; затем по 30-35 мг/сут, 1 нед; по 20-25 мг/сут 1 нед; по 15-20 мг/сут. 3 сут; по 10-5 мг/сут. 3 сут; и по 5 мг/сут. до полной отмены (согласно руководству «Рациональная фармакотерапия кожных и венерических болезней», под общей редакцией , , Москва, издательство «Литтерра», 2005). Группа пациентов с ГА средней степени тяжести (S2-S4а) получали как дипроспан в/к, так и преднизолон внутрь в зависимости от клинической формы и торпидности заболевания.

Для оценки эффективности проводимой терапии были выбраны следующие критерии:

- полный косметический эффект – зарастание пигментированными волосами более 75% площади очага облысения;

- частичный косметический эффект - зарастание пигментированными волосами менее 75% площади очага поражения, отрастание волос в виде островков, отрастание пушковых волос;

- отсутствие эффекта.

Морфологические и ИГХ-исследования выполнены на биопсийном материале от 28 больных ГА на кафедре патологической анатомии Первого МГМУ им. . Забор образца ткани проводился в очаге облысения на коже скальпа с помощью одноразового punch-биоптата диаметром 4 мм у 14 пациентов с активной стадией ГА и у 14 пациентов с хронической стадией.

Для контроля исследования использовались биоптаты кожи 7 здоровых людей, которые были взяты с волосистой части головы во время проведения косметических операций.

После взятия биопсийный материал фиксировали в 4% растворе формалина в течение 48 ч и заливали в парафин с установкой биоптатов «на ребро». Затем приготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином по общепринятой методике. Часть серийных парафиновых срезов монтировали на стекла с поли-L-лизиновым покрытием для ИГХ исследований. ИГХ-исследования проводили с применением моноклональных антител к CD4+, CD8+, CD68+, IL-2, IFN-γ, TNF-a («LabVision», в разведении 1:100). В качестве вторичных антител применялась смесь противомышиных и противокроличьих антител с авидин-биотиновым комплексом (АВК KIT, DAKO). Ставили положительные и отрицательные ИГХ контроли.

Оценивали общие морфологические процессы при ГА, такие как наличие воспалительного инфильтрата и его распределение, наличие склероза, патология эпителия фолликулов, присутствие волос в ВФ. С помощью ИГХ окраски определяли клеточный и цитокиновый состав воспалительного инфильтрата.

Проводилась полуколичественная и количественная оценка результатов реакций. Результаты ИГХ реакции для цитокинов оценивались полуколичественным методом в баллах по количеству позитивно окрашенных клеток. Оценка интенсивности реакции для СD4, CD8, CD68 проводилась по подсчету процента положительно окрашенных клеток в инфильтрате на 300 клеток инфильтрата. Для IL-2, IFN-гамма, TNF – альфа проводилась по 6-ти бальной системе: 2 балла – до 20% окрашенных клеток; 4 балла – от 20 до 40% окрашенных клеток; 6 баллов – более 40% окрашенных клеток инфильтрата.

Достоверность различий по экспрессии маркеров оценивалась статистическим непараметрическим критерием сравнения Уайта для малых выборок.

Результаты исследования и их обсуждение.

Результаты клинических исследований

Обследованы 54 пациента (18 мужчин и 38 женщин) с ГА в возрасте от 18 до 56 лет, которые были разделены на 2 группы с учетом активности заболевания (рис. 1-см. на цветной вклейке).

Первую группу составили пациенты с активной стадией заболевания и жалобами на усиленное выпадение волос, сопровождающееся формированием очагов облысения, субъективно ощущались симптомы в виде умеренного зуда, жжения, чувства ползания мурашек в коже скальпа, где позже формировались очаги алопеции. При клиническом осмотре отмечались такие симптомы, как: наличие очагов облысения с четкими границами, слегка гиперемированных, в самих очагах и по краю - волосы, обломанные на высоте 1-2 мм, с утолщением дистальных концов, а также кадаверизованные волосы в виде чёрных точек в устье фолликулов; при ручной эпиляции волос на границе очагов выявлялась зона расшатанных волос шириной около 0,3-1 см, в которой легко эпилировались телогеновые либо дистрофичные волосы, многократно расщепленные и обламывающиеся у основания их выхода из устья ВФ на поверхность кожи.

Вторую группу составляли пациенты с хронической стадией ГА, которые жаловались на отсутствие роста волос, при этом субъективные жалобы, связанные с нарушением или изменением чувствительности кожи в очагах облысения, отсутствовали. Клиническая картина заболевания имела более скудные симптомы: кожа в очагах облысения была обычной окраски и слегка гипотрофична, устья фолликулов не визуализировались, отсутствовала зона расшатанных волос, чёрные точки кадаверизованных волос или волосы в виде «восклицательного знака» не выявлялись.

Результаты морфологических и ИГХ-исследований.

Были изучены биоптаты кожи скальпа 28 больных с клиническим диагнозом ГА, подтвержденным гистологически. Из них 14 образцов были получены у пациентов 1 группы с активной стадией заболевания и 14 образцов у пациентов 2 группы с хроническим процессом.

В образцах кожи пациентов первой группы при окрашивании гематоксилином и эозином морфологическая картина активной стадии ГА характеризуется наличием обильного неспецифического воспалительного инфильтрата, состоящего из Т-лимфоцитов, макрофагов и других лимфо-гистиоцитарных элементов, включая клетки Лангерганса. Эозинофилы в составе клеток инфильтрата не обнаружены. Неспецифический воспалительный инфильтрат выявляется во всех 14 биоптатах, при этом основную массу клеток составляют Т-лимфоциты и макрофаги.

Инфильтрат располагается как вокруг ВФ, так и вокруг сосудов. С учётом распределения инфильтрата было выявлено 3 морфологических типа воспаления (рис. 2 – см. на цв. вклейке):

- преимущественной перифолликулярной инфильтрацией – у 5 из 14 больных с активной стадией ГА (рис. 3а – см. на цв. вклейке)

- с преимущественной периваскулярной инфильтрацией – у 4 из 14 больных с активной стадией ГА (рис. 3б – см. на цв. вклейке)

- смешанный вариант (инфильтрация как вокруг сосудов, так и вокруг ВФ)– у 5 из 14 больных с активной стадией ГА (рис. 3в – см. на цв. вклейке)

В биоптатах с преимущественной перифолликулярной инфильтрацией, воспалительный клеточный инфильтрат локализуется вокруг ВФ в нижней их части. При этом часть воспалительных элементов проникает внутрь корневых частей волосяного фолликула, между эпителиальными клетками наружной и внутренней оболочек эпидермального влагалища корня волоса. Эти данные отражают морфогенез аутоиммунного воспаления, которое наблюдается в коже больных ГА в активную стадию.

В активной стадии ГА отмечается также патология эпителия ВФ в виде выраженного дис - и паракератоза (в единичных биоптатах наблюдались признаки апоптоза), инфильтрация стромы. В некоторых биоптатах можно отметить изменения в шиповатом слое в виде внутриклеточного отека, разрыхления и фрагментации коллагеновых волокон в дерме, расширения сосудов с утолщением их стенок. Устья ВФ расширенны, в большинстве ВФ волосы отсутствуют, однако в единичных образцах, взятых из зоны расшатанных волос, воспалительный инфильтрат окружает дистрофичные терминальные волосы в фазе анагена.

У пациентов с хронической стадией заболевания при гистологическом исследовании выявляются скудные перифолликулярные и периваскулярные инфильтраты, отмечается уменьшение количества ВФ, их атрофия, выраженный перифолликулярный и периваскулярный склероз, склероз дермы, который заключается в утолщении коллагеновых волокон, наличии фиброзных тяжей, уменьшении отека тканей, утолщении стенок сосудов, скоплении фибробластов вокруг ВФ и в толще дермы, в редких случаях наблюдаются явления ангиогенеза (рис. 4 – см. на цв. вклейке). Волосы в ВФ полностью отсутствуют. Эти изменения характерны для процессов регенерации и склероза. В биоптатах кожи здоровых доноров скопления перифолликулярного и периваскулярного инфильтрата не выявлено.

ИГХ-исследования клеточного состава инфильтрата.

При ИГХ исследовании в активную стадию ГА основную массу клеток перифолликулярного и периваскулярного инфильтрата составляют Т-лимфоциты: CD8+ - до 67%, CD4+ до 10%, CD68+ до 23%. Хроническая стадия ГА характеризуется снижением абсолютного количества CD8+ CD4+ CD68+ клеток инфильтрата в поле зрения (до 2, 5 и 10 клеток соответственно), тогда как в процентном соотношении происходит перераспределение клеток с уменьшением CD8+ (до 35 %) и относительным увеличением CD4+ и CD68+ (до 15 % и 50 % соответственно) (рис. 6 а, б – см. на цв. вклейке).

Таким образом, в отличие от здорового контроля, где клетки CD4+ не выявляются вовсе, определяются единичные CD8+ и CD68+ клетки, в активную стадию ГА основную массу клеток перифолликулярного и периваскулярного инфильтрата составляют CD8+ Т-лимфоциты - Т-супрессоры, которые, по-видимому, обуславливают формирование цитотоксического иммунного ответа. Считают, что высокое содержание CD8+ лимфоцитов за счет кооперации с Т-хелперами (CD4+) и макрофагами (CD68+) формирует опосредованный Т-клетками цитотоксический иммунный ответ и обеспечивает иммунный цитолиз клеток ВФ [, 2004; Bodemer C., Peuchmaur M., et al. 2000]. В хроническую стадию ГА происходит изменение количественного состава клеток воспалительного инфильтрата с уменьшением цитотоксических Т-лимфоцитов и преобладанием CD68+ макрофагов. Тканевые макрофаги или гистиоциты являются ведущими клетками, участвующими в процессах регенерации тканей, а также стимулируют ангиогенез и синтез коллагена. На основании этого можно сказать, что местные иммунные нарушения в активной стадии ГА в виде признаков воспаления, сменяются в хронической стадии заболевания на процессы регенерации и склероза (табл. 2).

Таблица 2

Распределение клеток воспалительного инфильтрата при ИГХ в активную и хроническую стадии ГА

Наименование маркера	ГА острая, n=14	ГА хроническая, n=14	Здоровый контроль n=7
Клетки в поле зрения в % (абс)*	Клетки в поле зрения в % (абс)*	Клетки в поле зрения в % (абс)*
CD 4+	10 % (12)	15 % (2)	0 % (0)
CD 8+	67 % (67)	35 % (5)	37 % (1)
CD 68+	23 % (23)	50 % (10)	67 % (2)

* p<0,01 по критерию Уайта

ИГХ-исследования провоспалительных цитокинов.

Под действием активированных Т-лимфоцитов происходит повышенная продукция провоспалительных Th1-цитокинов [Brajac I., Gruber F. еt al., 2004; Shapiro J., Madani S., 2005; Chodorowska G., Dabrowska-Czlonka M. еt al, 2007]. Это отражает механизм развития реакции гиперчувствительности IV типа (РГЧ –IV типа или гиперчувствительность замедленного типа), которая обусловлена клеточными иммунными реакциями сенсибилизированных Т-лимфоцитов, проявляющих цитотоксичность путем секреции цитокинов [, (ред.), 2006].

В нашей работе мы исследовали спектр IL-2, IFN-γ и TNF-a цитокинов в клетках лимфогистиоцитарного инфильтрата при острой и хронической стадиях ГА (рис. 5а, б,в – см. на цв. вклейке).

Характеризуя профиль Th-1 провоспалительных цитокинов при ГА следует отметить повышенное содержание IFN-γ в воспалительном инфильтрате (5 баллов) и внутри волосяных фолликулов (4 балла), причем эти значения одинаковы как в активную, так и в стационарную стадии ГА. Провоспалительный цитокин IL-2 определяется в большей степени в активную стадию ГА как в воспалительном инфильтрате (ВИ) (до 6 баллов), так и в ВФ (до 2 баллов), однако его содержание несколько снижается при хронической форме заболевания. Высокое содержание TNF-a больше выражено в активную стадию заболевания (до 6 баллов), оставаясь повышенным в хроническую стадию (до 4 баллов) (табл. 3).

Таблица 3

Распределение провоспалительных цитокинов при ИГХ в активную и хроническую стадии ГА

Наименование маркера	Локализация маркеров	ГА острая Балл *	ГА хроническая Балл *	Здоровый контроль Балл *
IL-2	ВФ	2	1	1
ВИ	6	4	1
IFN-γ	ВФ	4	4	0
ВИ	5	5	0
TNF-a		6	4	0

* p<0,01 по критерию Уайта

Следовательно, иммунный цитолиз клеток ВФ осуществляется не только за счет Т-лимфоцитов, но и провоспалительных цитокинов Th-1, таких как IL-2, IFN-γ и TNF-a. При этом предполагают, что IL-2 играет роль инициатора аутоиммунного воспалительного процесса [Brajac I., Gruber F., Petrovecki M.,2004]. В настоящее время IFN-γ рассматривается как единственный цитокин, способный индуцировать HLA-DR антигены в клетках волосяных фолликулов, что является важным условием специфического взаимодействия цитотоксических Т-лимфоцитов с эпителием матрикса волоса [O'Shea J., Ma A. & Lipsky., 2002; Katagiri K., Arakawa S., Hatano Y., 2007]. TNF-a, являясь сильным индуктором апоптоза, подавляет пролиферацию кератиноцитов и совместно с IFN-γ оказывает синергичный антипролиферативный эффект, что также обусловливает возможную роль TNF-a в иммунном механизме развития очаговой алопеции [Thein C., Strange P., Hansen ER.,1997; Hibino T., Nishiyama T. 2004]. Высокое содержание TNF-a, больше выраженное в активную стадию заболевания, подтверждает его участие в механизмах цитотоксического повреждения ВФ. Исследуемые цитокины продуцируются клетками как лимфогистиоцитарного инфильтрата, так и ВФ при их иммунном повреждении. Мы подтвердили это, обнаружив IL-2 и IFN-γ в воспалительном инфильтрате и между клетками матрикса ВФ. Поврежденный эпителий ВФ является главным продуцентом TNF-a, подготавливая тем самым апоптоз поврежденных клеток.

Сопоставив результаты морфологического и ИГХ исследования с клинической картиной заболевания, можно выявить соответствие между активностью патологического процесса и местными иммуноморфологическими изменениями в коже при ГА. Так, в активную (острую) стадию заболевания в биоптатах кожи определяется массивный воспалительный инфильтрат с преобладанием цитотоксических Т-лимфоцитов (CD 8+) и повышенным содержанием провоспалительных цитокинов (IL-2, TNF-a, IFN-γ), что характерно для иммунного воспаления, соответствующего РГЧ IV типа. Учитывая клиническую картину активной стадии ГА, можно предположить, что именно эти местные иммунные реакции являются причиной размягчения и выпадения волос, а также изменений кожи в виде легкой гиперемии и субъективных ощущений по типу парестезии. Напротив, в хроническую (стационарную) стадию ГА, когда в очаге алопеции отсутствуют признаки гиперемии кожных покровов и признаки расширения границ облысения, патоморфологические и ИГХ-изменения проявляются минимальной степенью клеточного ответа в виде уменьшения воспалительного инфильтрата, появлением признаков перифолликулярного и периваскулярного склероза и перераспределением клеток инфильтрата (CD 8+ и CD 4+ лимфоцитов) с преобладанием фибробластических и макрофагальных элементов (CD 68+). Содержание провоспалительных Th-1 цитокинов (IL-2, TNF-a) в хроническую стадию ГА также достоверно снижается (p*<0,01). Эти изменения отражают смену воспалительной реакции в очаге ГА на репаративные и склеротические механизмы.

Данные, полученные в нашем исследовании, свидетельствуют о нарушении местных иммунных реакций в очагах облысения при ГА, которые связаны с активацией Т-лимфоцитов: появлением активированных CD4+ и увеличением CD8+, изменением цитокинового профиля IL-2, и появлением IFN-γ и TNF-a,. Подобные изменения в поражённой ткани способствуют усилению апоптоза и формированию деструктивных изменений в матриксе ВФ. На основании этого можно говорить, что патогенез ГА развивается по механизму аутоиммунного воспаления, в связи с чем подходы к терапии ГА должны быть направлены на подавление цитотоксических Т-лимфоцитов и цитокинов Th-1 типа.

Результаты проведенного лечения

Всем пациентам с ГА было назначено лечение кортикостероидами в методиках, соответствующих тяжести заболевания и степени его активности.

Местное лечение дипроспаном получили 27 человек (50%) с ГА с потерей волос до 74% от общего количества волос на коже скальпа. Дипроспан вводился внутрикожно полипозиционно в расчете 0,1 мл на 1 см2 очага поражения однократно 1 раз в месяц. При необходимости инъекции повторяли. В общей сложности продолжительность курса составляла от 1 до 3 месяцев. После внутриочагового введения дипроспана у пациентов с ГА рост пушковых волос отмечался, в среднем, после 3 недель, рост терминальных пигментированных волос – через 3-4 недели после введения дипроспана. У 11 пациентов с легкой степенью и 6 со среднетяжелой степенью ГА, имевших продолжительность эпизода менее 3 мес. отрастающие в очаге волосы в большей степени имели пигментированный характер. Результаты лечения дипроспаном показаны в табл. 4

Таблица 4

Эффективность лечения больных дипроспаном с легкой и среднетяжелой формами ГА

Степень тяжести	Результаты лечения	всего
Полный эффект	Частичный эффект	Отсутствие эффекта
Легкая степень	12 (63%)	5 (26%)	2 (11%)	19 (100%)
Среднетяжелая	1 (12,5%)	4 (50%)	3 (37,5%)	8 (100%)
Итого	13 (48%)	9 (33,5%)	5 (18,5%)	27 (100%)

Рецидив заболевания в виде расширения зоны очага облысения либо появления новых очагов спустя 1-3 месяца после прекращения местного лечения дипроспаном имели 16 человек (73%) из 22 пациентов с полным или частичным косметическим эффектом: у 6 пациентов с легкой формой заболевания и у 3 человек со средней тяжестью.

15 пациентов, имеющие офиазис, субтотальную, тотальную и универсальную формы ГА, получали системную терапию преднизолоном. Эффективность терапии преднизолоном показана в таблице 5.

Таблица 5

Эффективность терапии преднизолоном у больных тяжелой и среднетяжелой формами ГА

Степень тяжести	Результаты лечения	всего
Полный эффект	Частичный эффект	Отсутствие эффекта
Среднетяжелая	3 (50%)	2 (33%)	1 (17%)	6 (100%)
Тяжелая	2 (22%)	4 (45%)	3 (33%)	9 (100%)
Итого	5 (33%)	6 (40%)	4 (27%)	15 (100%)

Рецидивы заболевания у пациентов с ГА, полностью или частично ответивших на системную терапию преднизолоном, отмечались у 10 человек (91%, из них 3 человека со среднетяжелой формой ГА в виде офиазиса и 7 пациентов с тотальной и универсальной ГА) и наблюдались при снижении дозы преднизолона или после прекращения лечения в течение 1-2 месяцев.

Таким образом, можно сделать вывод, что эффективность лечения выше у пациентов с недлительным (до 3 месяцев) периодом активности ГА, в то время, как пациенты с распространенной потерей волос (50-100%) и длительным течением заболевания плохо реагируют на лечение, и, в большинстве случаев, имеют частичный эффект или лечение не эффективно. При этом среди пациентов, получавших как местное лечение дипроспаном, так и системное лечение преднизолоном, отмечается высокий процент рецидивов (73% и 91% соответственно), при этом основное место также занимают пациенты с длительностью заболевания более 3-6 месяцев и высокими показателями тяжести алопеции S3- S5.

Выводы

1. При гнездной алопеции местные иммунные нарушения коррелируют с активностью патологического процесса и сочетаются с клиническими проявлениями активности процесса. Данные морфологических и иммуногистохимических исследований отражают существующую местную тканевую воспалительную реакцию в активной стадии гнездной алопеции, которая сменяется в хронической стадии на репаративные и склеротические процессы в тканях с преобладанием перифолликулярного и периваскулярного склероза.

2. Гнездная алопеция имеет иммунный патогенез с развитием клеточно-опосредованной реакции гиперчувствительности IV типа. Цитотоксический эффект при гнездной алопеции осуществляется за счет кооперации цитотоксических Т-лимфоцитов (CD 8+) как c Т-хелперами (CD 4+) , так и CD 68+ макрофагами и клетками Лангерганса.

3. Иммунный цитолиз клеток волосяных фолликулов осуществляется не только за счет Т-лимфоцитов, но и за счет гиперпродукции провоспалительных Th-1 цитокинов (IL-2, IFN-γ и TNF-a), вырабатываемых как клетками воспалительного инфильтрата, так и клетками волосяных фолликулов при их иммунном повреждении.

4. Пациенты с обширной потерей волос и длительным течением патологического процесса плохо реагируют на патогенетическую терапию с применением кортикостероидов: из 15 пациентов полный эффект отмечен у 5 (33%) человек, частичный эффект – у 6 (40%), отсутствие эффекта - у 4 (27%). Эффективность гормональной терапии несколько выше у пациентов с небольшими размерами очагов и недлительным течением заболевания: из 27 пациентов полный эффект – у%) человек, частичный эффект – у 9 (33,5%), отсутствие эффекта – у 5 (18,5%). Эти результаты обусловлены клинико-морфологическими особенностями и характером местных иммунных реакций в очагах гнездной алопеции.

Практические рекомендации

1. У пациентов с гнездной алопецией рекомендовано проведение патоморфологических и иммуногистохимических исследований биоптатов кожи из очагов облысения и назначение лечения с учетом полученных результатов.

2. В активную стадию гнездной алопеции, характеризующуюся развитием местного иммунного воспаления, рекомендовано гормональное противовоспалительное лечение, направленное на подавление цитотоксических Т-лимфоцитов и провоспалительных цитокинов.

3. В хронической стадии гнездной алопеции на фоне уменьшения воспалительных реакций, в тканях преобладают процессы регенерации и склероза, в связи с чем противовоспалительная терапия должна быть дополнена средствами, улучшающими микроциркуляцию в тканях и обладающими антифиброзной и антисклеротической активностью.

4. Лечение гнездной алопеции на ранних сроках приводит к быстрой ликвидации патологического процесса; при длительном течении заболевания и частых рецидивах прогноз неблагоприятный.

Список опубликованных работ:

1. , , Терещенко представления об этиологии и патогенезе очаговой алопеции. //Клиническая дерматология и венерология, 2009, № 4, с.4-7.

2. Терещенко анализ клеток перибульбарного инфильтрата при гнездной алопеции. Материалы научных трудов II Международного форума медицины и красоты. – Москва, 2009. – С. 181-182.

3. , , Иммуногистохимический анализ в оценке местных иммунных патогенетических механизмов развития гнездной алопеции. // Врач, 2010, № 4, с. 75-78.

4. , , Терещенко процессов апоптоза, пролиферации, неоангиогенеза и клеточной дифференцировки при иммунном воспалении в очагах гнездной алопеции. //Клиническая дерматология и венерология, 2010, № 2, с.23-31.

5. , , Демура местных иммунных механизмов воспаления при гнездной алопеции с учетом активности заболевания. //Клиническая дерматология и венерология, 2010, № 5, с.103-108.

Список сокращений

ВФ – волосяной фолликул

ГА – гнездная алопеция

ИГХ – имунногистохимический

Т-С – Т-супрессоры

Т-Х – Т-хелперы

IFN-γ – интерферон гамма

IL-2 – интерлейкин 2

TNF-α – фактор некроза опухоли альфа

Рис. 1 Распределение пациентов в соответствии со стадией и степенью активности заболевания