Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (стр. 10 )

Основные свойства бактериальной биопленки:

•  взаимодействующая общность разных типов микроорганизмов;

•  микроорганизмы собраны в микроколонии;

•  микроколонии окружены защитным матриксом;

•  внутри микроколоний – различная среда;

•  микроорганизмы имеют примитивную систему связи;

•  микроорганизмы в биопленке устойчивы к воздействию антибиотиков, антимикробных средств и к реакции организма хозяина.

Бактерии способны образовывать биопленки на любом субстрате – это и поверхности внутренних органов, протезы, зубная эмаль, стенки катетеров и контактных линз. Известно, что именно биопленки являются причиной внутрибольничных инфекций и хронических инфекционных заболеваний. Тем не менее, активно ведутся исследования по использованию способности бактерий к самоорганизации в «мирных» целях. Одним из направлений, где активно ведется исследование по применению бактериальных биопленок, является биоремедиация среды.

Биоремедиация – это ряд мероприятий, направленных на оздоровление окружающей среды, путем утилизации поллютантов, осуществляемое с участием живых микроорганизмов.

На сегодняшний день существуют различные сооружения для очистки промышленных и бытовых сточных вод, в которых осуществляется биодеградация и трансформация органических и минеральных веществ, содержащихся в стоках, в аэробных или анаэробных условиях. По способу контакта очищаемой сточной воды и колоний микроорганизмов различают сооружения очистки сточных вод с иммобилизованной (прикрепленной) микрофлорой и свободноплавающей (табл.5). В настоящее время известно много модификаций, совмещающих в одном сооружении очистки стоков оба механизма. Базовыми вариантами современных сооружений очистки сточных вод являются классические биофильтры, аэротенки и анаэробные биореакторы. Очистные реакторы на основе биопленок, в основном, используются для больших акваторий в местах индустриальных стоков и способны пропускать большие объемы воды. Аэробная биодеструкция органических загрязняющих веществ сточных вод в биофильтрах осуществляется путем фильтрования сточных вод через загрузочный материал, на нем постепенно адсорбируются органические вещества (поллютанты) и микроорганизмы, находящиеся в сточной воде. Образуется так называемый биоорганоминеральный комплекс - биопленка, используемая в технологии биологической очистки промышленных и бытовых сточных вод.

Иммобилизованные (прикрепленные) микроорганизмы адсорбируют субстрат (питательные вещества) из сточной воды, омывающей загрузочный материал. В процессе обмена веществ они с помощью экзоферментов ускоряют процесс гидролиза сложных веществ, содержащихся в сточных водах, до более простых, молекулы которых имеют размеры меньшие, чем размеры бактерий. Продукты гидролиза диффундируют в клетку, где под действием эндоферментов происходит их дальнейшее окисление с целью получения энергии и более простых соединений, используемых в качестве строительных блоков клеточного вещества. Состав продуктов окисления зависят от состава субстрата и видового разнообразия бактерий, образующих биопленку, обязательно присутствуют углекислый газ и вода, в различном количестве могут присутствовать сульфаты, фосфаты, азот аммонийный и нитратный, а также продукты неполного разложения - различные органические кислоты.

Биопленка, используемая для участия в биоремедиации должна обладать способностью к биосорбции, биоаккумуляции и биоминерализации загрязняющих веществ, а также сродством бактериальных клеток в составе биопленки к определенному виду поллютанта.

Высокая плотность микробных клеток и уникальная архитектура биопленки способствуют поддержанию оптимального pH среды, концентрации питательных веществ в среде и окислительно-восстановительного потенциала в межклеточном пространстве

Современные возможности генной инженерии при помощи сочетания нескольких генов или активации одного гена позволяют запустить развитие полезных свойств, имеющихся у бактериальных штаммов. Например, создание штаммов с металлосвязующими способностями возможно путем экспрессии генов металлоспецифичных протеинов и пептидов, что усовершенствует процесс утилизации тяжелых металлов природными штаммами.

Таблица 5

Типы биореакторов/ экспериментальные условия	Методы ремедиации	Утилизируемые тяжелые металлы
Анаэробные / аэробные процессы в биопленке	Биосорбция	Zn, Cd, Ni
Биопленка, растущая на подвижной песчаной подложке	Биосорбция и осаждение	Cu, Zn, Ni, Co
Вращающийся биореактор для утилизации водорослей	Иммобилизация	Co
Биопленка на подложке из гранулированного угля	Адсорбция	Cd, Cu, Zn, Ni
Антибактериальный коплексный мембранный биореактор	Осаждение	Cd, Zn, Cu, Pb, Y, Co, Ni, Pd, Ge

Таким образом, сочетание методов генной инженерии микроорганизмов, с оптимальными физико–химическими параметрами и концентрацией субстрата в биореакторах является основным условием развития стратегий биремедиации.

, ,

Глава 6. Современные методы идентификации и детекции

физиологического статуса водных микроорганизмов

Изучение функционирования пресноводных экосистем в современных условиях является одной из приоритетных научных проблем, так как в настоящее время более половины населения Земного шара вынуждены употреблять для питьевых целей воду, не соответствующую нормам и стандартам. Микробные сообщества – одни из наиболее существенных компонентов живого населения водоемов. Они играют важную роль в процессах круговорота веществ и энергии и в трофической цепи организмов пелагиали. В природной микробной популяции бактериальные клетки находятся в разном физиологическом статусе: живые клетки могут быть метаболически активными и неактивными – покоящимися (резистентными) или спорами, а какую-то часть биомассы составляют мертвые клетки. Способности этих бактерий к культивированию различны, и их доля от общей численности может варьировать от 0.25% (культивирование из пресноводных источников) до 2% (из морской воды) (Amann et al., 1995; Bernard et al., 2000, Белькова, 2004). Сложные органические субстраты успешно применяются для выращивания большого разнообразия бактериальных штаммов и для выделения численно доминирующих, способных к культивированию бактериальных клеток из различных водных экосистем (Pinhassi et al., 1997). Оптимизация методов культивирования гетеротрофных бактерий позволяет проводить культивирование микроорганизмов, находящихся в природной среде в некультивируемом состоянии (Bussmann et al., 2001, Hahn et al., 2004). Успехи молекулярной систематики позволяют микробиологам пользоваться принципиально новыми возможностями решения таксономических проблем. В настоящее время описание и регистрация нового штамма микроорганизма не возможны без определения нуклеотидной последовательности гена малой субъединицы рибосомной РНК (гена 16S рРНК) и установления по этой структуре филогенетических взаимоотношений этого штамма с его ближайшими родственниками. Таким образом, селективная детекция микроорганизмов разного физиологического статуса разными методами: с помощью культивирования и молекулярно-генетическим становится актуальной научной задачей.

Основными целями исследования стали: (1) молекулярно-генетический анализ природных микробных сообществ ультраолиготрофных экосистем разного происхождения; (2) поиск новых подходов для анализа некультивируемых микроорганизмов. Мы использовали новый метод фильтрации-акклиматизации для культивирования микроорганизмов, находящихся в природных условиях в некультивируемом состоянии. Обработку водных проб из пресноводных озер Восточной Сибири проводили по следующей схеме: (1) культивирование гетеротрофных микроорганизмов и подсчет их численности; (2) эксперимент по фильтрации-акклиматизации; (3) молекулярно-генетическая идентификация штаммов; (4) концентрирование бактериального материала на бактериальных фильтрах и его молекулярно-генетический анализ. Среди культивируемых гетеротрофных микроорганизмов определены представители следующих родов: Aeromonas, Arthrobacter, Escherichia, Dietzia, Flavobacterium, Microbacterium, Rhodococcus и Serratia. Метод фильтрации-акклиматизации был адаптирован для проведения полевых экспериментальных работ по культивированию микроорганизмов из природных микробных сообществ, находящихся в некультивируемом состоянии. После эксперимента по фильтрации акклиматизации преимущественно получены неспорообразующие бактерии Pseudomonas и Acinetobacter. Молекулярно-генетический анализ природных проб выявил новые кластеры некультивируемых микроорганизмов.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантом РФФИ №09-04-00977 и в рамках интеграционного проекта № 000 (рук. ).

, ,

Глава 7. Поиск и исследование новых антимикробных метаболитов, продуцируемых бактериями

озера Байкал

В настоящее время широкое использование антибиотиков в медицинских и немедицинских (ветеринария, животноводство, растениеводство, пищевая и бродильная промышленность, научные исследования) целях привело к возникновению в окружающей среде антибиотикорезистентных штаммов бактерий. Это бактерии группы кишечной палочки [Srinivasan et al., 2007], энтерококки [Johnston & Jaykus, 2004], некоторые виды рода Bacillus, коринеформные бактерии, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes [Gravenitz, 2001] и другие. В последние годы наиболее ярким примером антибиотикорезистентности является возникновение устойчивости к ванкомицину у 12% штаммов Enteroccocus faecalis (с 1988 г.) и некоторых штаммов S. aureus (с 2002 г.) [Appelbaum & Jacobs, 2005].

Одним из основных путей преодоления антибиотикорезистентности является поиск и изучение антибактериальных метаболитов микроорганизмов, обитающих в окружающей среде. Решением этой проблемы в настоящее время занимаются объединенные группы ученых биологов и биохимиков разных стран мира, таких как Япония, Германия, Франция, Россия, Америка, Австралия, Индия, Китай и т. д. Водная среда в течение последних 20 лет является богатой лабораторией для выделения таких продуцентов. Установлено, что антимикробная активность продуктов метаболизма водных штаммов бактерий не уступает активности почвенных штаммов [Sponga et al., 1999]. Большой интерес представляет исследование микробного сообщества озера Байкал - уникального древнего пресноводного водоема, в котором обнаружено большое количество редких и специфичных для озера микроорганизмов [Белькова и др., 2003; Шубенкова и др., 2005]. Особые экологические условия в оз. Байкал, в первую очередь низкое содержание растворенного органического вещества и биогенных элементов, а также постоянные низкие температуры, оказывают значительное влияние на жизнедеятельность микроорганизмов, создают антагонистические взаимоотношения между бактериями, которые могут продуцировать уникальные по своей структуре и свойствам антимикробные метаболиты.