Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (стр. 14 )

Наибольший интерес представляют собой результаты, полученные при сравнении суммарных показателей гемагглютинации с исследованиями по выявлению у модиолусов различных гистопатологий (результаты любезно предоставлены , ИБМ ДВО РАН). В ходе сравнительного анализа было выявлено, что наличие патологических изменений органов, в виде аномальной вакуолизации клеток ПВЖ и деструкции клеток почечных канальцев, сопровождается заниженным титром гемагглютинации. Для доказательства непосредственной связи этих двух фактов был рассчитан коэффициент корреляции, который составил –0,578. Данное значение подтверждает наличие корреляции.

По результатам работ с M. kurilensis в 2007 г. можно с уверенностью сказать, что наиболее активно реакция прямой гемагглютинации проходила с Эр групп О и А для представителей со всех станций. Кроме того, данные говорят о схожести иммунного статуса животных из различных акваторий, собранных в один и тот же период.

В работе 2009 г. на A. broughtoni было установлено, что наибольшая активность агглютинирующих факторов проявляется в отношении Эр группы крови АВ, а наименьшая – к Эр группе О. Кроме того, сезонные сравнения показали изменение активности агглютинирующих факторов: титры реакции с плазмой животных, взятых в низкотемпературный период, ниже, чем таковые у животных в период активации метаболизма, вызванных повышением температуры до устойчивых положительных значений (+5 – +7оC). Этот факт необходимо учитывать при оценке иммунного статуса этих животных.

Все полученные данные могут позволить разработать метод диагностики состояния здоровья M. kurilensis и A. broughtoni в естественных и культивируемых популяциях.

Работа поддержана Государственным контрактом с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.740.11.0292.

,

Глава 12. ПОКАЗАТЕЛИ ФАГОЦИТОЗА ГЕМОЦИТОВ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ MODIOLUS KURILENSIS ИЗ НЕКОТОРЫХ АКВАТОРИЙ ЯПОНСКОГО МОРЯ С НЕЗНАЧИТЕЛЬНОЙ АНТРОПОГЕННОЙ НАГРУЗКОЙ

Двустворчатые моллюски обладают гемальной системой циркуляции внутренней среды, которая сообщается с интерстициальными компартментами и формирует единую транспортно-защитную ткань, называемую гемолимфой, реагирующую на любые изменения, происходящие в окружающей среде. Важную роль в адаптивных и защитных реакциях животных играет фагоцитоз: как фактор клеточного иммунитета он отвечает за поглощение и удаление чужеродных агентов из организма. Ввиду активного развития аквакультуры и промысла ценных пищевых объектов, изучение защитных и адаптационных механизмов морских животных, в т. ч. моллюсков, актуально и необходимо. Modiolus kurilensis в силу его широкого распространения в Японском море также может являться удобным модельным объектом для мониторинговых исследований морских экосистем.

Данное исследование выполнено с целью оценки показателей фагоцитоза гемоцитов моллюсков из акваторий Японского моря как метода исследования активности клеточного иммунитета этих животных, а также оценки физиологического состояния двустворчатых моллюсков M. kurilensis при средне-нормальном фоне естественных патогенов.

Для исследования фагоцитоза определяли два показателя: фагоцитарную активность (ФА) – количество фагоцитирующих клеток и фагоцитарный индекс (ФИ) – среднее количество бактерий, поглощенных клеткой. Для достижения этой цели клеточные суспензии гемолимфы инкубировали с заранее термически убитыми и мечеными флуоресцирующим красителем FITC бактериями: Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens, Staphilococcus aureus. Затем препараты заключали в гидрофильную среду Mowiol 4.88 и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axioimager.

Раннее полученные нами данные по исследованию фагоцитарных свойств гемоцитов у M.kurilensis, собранных в бухте Троицы за 2006 год, показывают, что фагоцитарный индекс и фагоцитарная активность в отношении трех бактерий Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens и Staphylococcus aureus незначительно варьируют. В связи чем, для сравнения показателей фагоцитоза у модиолусов, взятых с трех станций (б. Троицы, б. Киевка и зал. Восток), нами было принято решение использовать в качестве чужеродного агента при подсчете данных лишь одну бактерию – Staphylococcus aureus.

Известно, что фагоцитарной активностью обладают не все типы гемоцитов моллюсков. По нашим данным у животных, собранных с трех станций, от 46 до 59 % гемоцитов M. kurilensis проявляют фагоцитарную активность.

При вскрытии моллюсков и дальнейшем исследовании у шести особей моллюсков, собранных в бухте Троицы, была обнаружена инвазивность тканей микроводорослями. У модиолусов с интенсивной тканевой инвазивностью микроводорослями (заражением охвачены гонада, мантия, ПВЖ) фагоцитарные показатели максимальны или приближаются к таковым. Моллюски, у которых микроводоросли выявлялись только в гемолимфе, имели средние фагоцитарные значения. Данная вариабельность, вероятно, связана с различным иммунологическим состоянием животного (активированное или угнетенное). У ряда моллюсков из бухты Киевка и залива Восток инвазии микроводорослей были выявлены лишь в гемолимфе, и ввиду этого, фагоцитарные показатели имеют различные значения. Особи, имеющие инвазии, равномерно располагаются по всей длине ранжированного ряда. Выраженной корреляции между показателями фагоцитоза и обнаруженной микрофитобионтной инвазией не выявлено, что, вероятно, может быть связано с необходимостью регистрировать степень выраженности и время развития инвазии.

Сравнение результатов по гистопатологическим изменениям в пищеварительной железе и почках, любезно предоставленных (ИБМ ДВО РАН), с полученными нами фагоцитарными показателями показало, что животные с гистопатологиями имеют невысокие показатели ФА и ФИ. Выявлена обратная коррелятивная связь между наличием патологий и показателями фагоцитоза, которая характеризуется для выборки из залива Восток как значительная и составляет – 0,51.

Средние значения фагоцитарной активности и фагоцитарного индекса незначительно дифференцируют три исследованные выборки и составляют 51,3±6,77 и 2,24±0,64, соответственно.

Результаты работы являются шагом к разработке метода диагностики физиологического состояния двустворчатых моллюсков в природе и аквакультуре, а кроме того, позволяют оценить естественную вариативность показателей иммунитета этих животных и установить в дальнейшем границы нормы и патологии для исследованных морфофункциональных изменений.

Работа поддержана Государственным контрактом с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.740.11.0292.

Глава 13. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФОТОМЕТРИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕМОЦИТОВ И ДИАГНОСТИКИ ГЕМОЦИТАРНОЙ НЕОПЛАЗИИ У ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ

Двустворчатые моллюски – объект, который часто используется в различных исследованиях, в т. ч. в целях биоиндикации и оценки качества среды. Это связано с тем, что двустворчатые моллюски являются фильтраторами морской воды и накапливают в своих тканях всевозможные мутагенные токсины, содержащиеся в среде их обитания. В результате генотоксического эффекта среды у животных развиваются различные патологические состояния, которые могут свидетельствовать о неблагоприятной экологической обстановке в данной акватории. Учитывая, что моллюски выступают как ценный объект промысла и аквакультуры во многих странах мира, оценка физиологического состояния этих гидробионтов, включая диагностику различных заболеваний, стала актуальной задачей для всех приморских регионов, экономика которых так или иначе связана с культивированием морских организмов.

Одним из наиболее чувствительных критериев, отражающих физиологическое состояние моллюсков, является изменение пролиферативной активности клеток гемолимфы, связанное с нарушениями клеточного (митотического) цикла гемоцитов и приводящее к опасному заболеванию – гемоцитарной неоплазии, сходной по своим проявлениям с лейкемией позвоночных животных. Ее распространение среди коммерчески значимых видов достаточно велико. Поражение и смертность в культивируемых популяциях моллюсков (до 95 %) наносит значительный экономический ущерб марикультурным хозяйствам. Во многих странах имеются лаборатории, занимающиеся проблемой гемоцитарной неоплазии двустворчатых моллюсков. На Дальнем Востоке России, несмотря на широкий охват огромной акватории Северной Пацифики, такие исследования единичны. Сотрудниками Института биологии моря ДВО РАН выявлены опухоли у некоторых видов двустворчатых моллюсков (модиолус, мидия, гребешок), обитающих в южной части Приморья (Usheva, Odintsova, 1997; Usheva, Frolova, 2000). Среди них зарегистрированы и случаи гемоцитарной неоплазии.

Механизмы возникновения и прогрессии опухолевого роста до сих пор до конца не поняты. Согласно господствующей теории, в нормальной клетке имеются эндогенные протоонкогены (гены инициации и прогрессии клеточного цикла), которые под действием мутаций превращаются в онкогены, что приводит к перерождению нормальных клеток в опухолевые. Мутации могут происходить как спонтанно, так и под воздействием мутагенных факторов – радиации, природных токсинов, тяжелых металлов, антропогенной органики и т. д. В качестве онкогенов могут выступать и экзогенные вирусы при внедрении их в геном эукариотической клетки.

Трансформированные (неопластические) клетки характеризуются бесконтрольным ростом, способностью проникать (метастазировать) в здоровые ткани, увеличением содержания ДНК в результате полиплоидизации клеток или, наоборот, его уменьшением в ходе апоптоза.

Диагностировать гемоцитарную неоплазию можно несколькими способами. Один из методов, применяемых в диагностических лабораториях, – гистологический анализ тканей. На препаратах мазков гемолимфы раковые клетки моллюсков выглядят более крупными и имеют увеличенное ядро (из-за избыточности генетического материала). В клетках также могут регистрироваться митозы и апоптотические явления (Usheva, Odintsova, 1997; Galimany, Sunila, 2008). Отмечено, что на ранних стадиях развития гемоцитарной неоплазии процент апоптотических клеток выше, чем на более продвинутых стадиях, где в большей степени регистрируются полиплоидные клетки (Galimany, Sunila, 2008). Гистологический метод выявления опухолей часто дополняется методом хромосомного анализа. Выявление лишних хромосом (анеуплоидии) или целых хромосомных наборов (полиплоидии) позволяет предположить наличие неоплазии. Цитогенетический метод, как и гистологический, достаточно трудоемок и требует много времени для анализа.