Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (стр. 11 )

Поэтому целью этой работы было выделить и исследовать антибактериальные вторичные метаболиты, продуцируемые бактериями озера Байкал в процессе своей жизнедеятельности.

1.  Материалы и методы

Выделение микроорганизмов из озера Байкал. Источником выделения бактерий были байкальские губки трех видов - Lubomirskaia baicalensis, Baicalospongia bacillifera и Baicalospongia intermedia и байкальская вода. Образцы губок отбирали при помощи водолазной техники в районе п. Листвянка (Lubomirskia baicalensis) с глубины 6 м и в районе пос. Большие коты с глубины 13 метров (Lubomirskia baicalensis) и 3,6м (Вaicalospongia bacilifera). Пробы воды отбирали асептически с корабля при помощи батометра в Южном Байкале. Методы выделения бактерий были опубликованы ранее (Парфенова и др., 2008).

Антимикробную активность чистых культур бактерий определяли двумя способами: методом перпендикулярных штрихов и методом одновременного культивирования продуцента и тест-культуры (Теркина и др., 2006). В качестве тест-культур использовали условно-патогенные штаммы бактерий Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium и Candida albicans.

Ферментативную активность бактерий определяли по качественной реакции (Парфенова и др., 2008).

Идентификацию выделенных штаммов бактерий с высокой антимикробной активностью проводили на основании морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков с помощью определителя бактерий Берги (Определитель бактерий Берджи, 1997).

Для получения культуральной жидкости бактерии культивировали в колбах Эрленмейера обьемом 250 см3 со 100 мл среды приведенного состава на установке для выращивания микроорганизмов УВМТ-12-250 (скорость качания 110 об/мин). Время культивирования 5 суток, при комнатной температуре. Культивирование проводили в течение 5 суток при комнатной температуре на следующих средах: среда I - рыбо-пептонный бульон (2 г/л) и среда (II): глицерин – 3 г, рыбо-пептонный бульон – 0.5 г, пептон – 0.5 г, NaCl – 0.45 г, CaCO3 – 0.35 г, H2O - 1л, pH= 7.2. Культуральную жидкость экстрагировали этилацетатом и концентрировали в вакууме для получения сухого остатка. Для определения активности экстрактов готовили этилацетатные и водно-спиртовые (не более 10 % спирта в воде) растворы. Антимикробную активность культуральной жидкости, а затем микробных экстрактов оценивали методом диффузии в агар (Медицинская микробиология, 1999). В качестве тест-культур были использованы штаммы E. coli, S. aureus, E. faecium и C. albicans.

Хроматографическое исследование микробных экстрактов. Для исследования микробного экстракта использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовой детекцией (ВЭЖХ-УФ). Хроматографические исследования были выполнены на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с колонкой Æ 2х75 мм, упакованной сорбентом Silasorb SPH C 18 с одновременной многоволновой ультрафиолетовой детекцией. Упаренный досуха бактериальный экстракт перерастворяли в 60% водном метаноле (10 мг/мл). Для общей характеристики бактериального экстракта записывали обзорную хроматограмму в градиенте от 2 до 100% метанола в воде. Для идентификации соединений, обладающих антимикробной активностью, бактериальный экстракт был разделен на 12 фракций. Каждая из фракций была выделена в полупрепаративном режиме и исследована на антимикробную активность в отношении E. faecium. Результат учитывали по величине диаметра зоны подавления роста вокруг лунки, измеренной в миллиметрах.

Масс-спектрометрический анализ соединения 11,5 мин проводили на приборе МХ 5303, оборудованном электрораспылительным источником ионизации с ортогональным вводом ионов и времяпролетным масс-анализатором (TOF) (ESI-o-TOF), разработанном в лаборатории экологической и биомедицинской масс-спектрометрии ИАнП РАН. Спектр получали в режиме съемки положительных ионов. При проведении хромато-масс-спектрометрического анализа в качестве подвижных фаз использовали: А - 0.5% НСООН в воде (pH 2.5), В - 0.5% НСООН в ацетонитриле. Скорость потока 150 мкл/мин. Градиент: линейный, от 2 до 75% Б за 2000 мкл, 75% Б 1000 мкл.

2.  Результаты и обсуждение

В результате проведенной научно-исследовательской работы из воды озера выделено 98 штаммов бактерий, а из байкальских губок 122 штамма бактерий. Обнаружено, что антимикробной активностью по отношению к условно-патогенным тест-культурам обладали 47% штаммов бактерий, выделенных из губок, и около 70% штаммов, выделенных из воды озера. Практически все бактерии, выделенные из воды, подавляли рост S. aureus и E. faecium. (рис. 5).

Рисунок 5 - Антимикробная активность бактерий,

выделенных из оз. Байкал

Ферментативная активность бактерий является одним из показателей их участия в разложении органических веществ (белков, жиров и углеводов). По результатам тестирования установлено, что бактерии, выделенные из воды и губок озера Байкал, обладают высокой гидролитической активностью. Выявлено 63.1% культур, способных пептонизировать молоко, более 60% обладают лецитиназной и липазной активностями, фосфатазную активностью проявляют 55.2% исследованных культур, 53.9% штаммов бактерий способны гидролизовать крахмал, 26.3% разжижают желатину. Больше половины исследованных культур проявляют сразу несколько активностей: фосфатазную, протеазную, лецитиназную и липазную (рис. 6).

Рисунок 6 - Ферментативная активность бактерий, выделенных из озера Байкал

По результатам тестирования для дальнейшей идентификации были выбраны 18 штаммов, обладающих высокой антимикробной и ферментативной активностями. Установлено, что 11 штаммов относятся к роду Pseudomonas, 3 штамма принадлежат к роду Flavobacterium, 2 штамма – к роду Acinetobacter и по 1 штамму к родам Aeromonas и Proteus. Чтобы оценить антимикробную активность бактерий при разных условиях культивирования, были выбраны четыре штамма Pseudomonas sp. 1Lb-06, Pseudomonas sp. 7Lb-06, Flavobacterium sp. 15Bb-06 и Flavobacterium sp.28Bb-06.

Штамм Pseudomonas sp.1Lb-06 угнетал рост S. aureus (диаметр зоны подавления роста (Æ) составлял 7мм), B. subtilis (Æ 13мм), C. albicans (Æ 6мм) и E. faecium (Æ 14мм), и проявлял протеазную активность (диаметр зоны лизиса (Æ) составлял 15мм), лецитиназную (Æ 10мм) и липазную (Æ 6мм) активности.

Штамм Pseudomonas sp.7Lb-06 был активен в отношении S. aureus (Æ 18мм), B. Subtilis (Æ 10мм), и также проявлял протеиназную (Æ15мм), лецитиназную (Æ 5мм) и липазную (Æ 12мм) активности.

Штамм Flavobacterium sp.15Lb-06 угнетал рост S. aureus (Æ 15мм), B. subtilis (Æ 28мм), C. albicans (Æ 14мм), E. faecium (Æ 22мм) и P.  aeruginosa (Æ 35мм), обладал протеазной (Æ18мм), коллагеназной (Æ 2мм), лецитиназной (Æ 19мм) и липазной (Æ 12мм) активностями.

Штамм Flavobacterium sp.28Bb-06 ингибировал рост S. aureus (Æ 30 мм), B. subtilis (Æ 15мм) и E. faecium (Æ 7мм), и проявлял протеазную (Æ16мм), лецитиназную (Æ 8мм) и липазную (Æ 11мм) активности.

Тестирование культуральной жидкости, полученной на среде I и среде II, показало, что спектр антимикробного действия этих бактерий зависит от времени культивирования и от состава среды культивирования. Обнаружено, что объем культуральной жидкости, используемой для тестирования, не влиял на антимикробную активность. Штаммы Pseudomonas sp. 1Lb-06, Pseudomonas sp. 7Lb-06, Flavobacterium sp. 15Bb-06 при культивировании на рыбо-пептонном бульоне (среда I) проявляли активность по отношению к E. faecium, S. aureus и C. albicans уже на 3 и 5 сутки, а на среде II выделяли антимикробное вещество только на 7 сутки.

В таблице приведены результаты тестирования культуральной жидкости штамма Flavobacterium sp.28Bb-06. Этот штамм был выбран как самый активный для выделения и исследования активного вещества. На среде I эта культура подавляла рост S. aureus и E. faecium (среда I) на третьи сутки культивирования и рост C. albicans – на 7 сутки. На среде II штамм Flavobacterium sp.28Bb-06 уже на 3 сутки культивирования показал активность в отношении S. aureus, btilis и на 7 сутки – к E. faecium. Кроме того, этот штамм обладал протеазной, лецитиназной и липазной ферментативной активностями.

Таблица 6 - Антимикробная активность штамма Flavobacterium sp.28Bb - 06 при разных условиях культивирования, (мм) [1]

Штамм	Тест-культура	Время культивирования
3 сутки	5 сутки	7 сутки
0.1 мл	0.3 мл	0.5 мл	0.1 мл	0.3 мл	0.5 мл	0.1 мл	0.3 мл	0.5 мл
Среда I	E. faecium	7	8	8	0	8	8	+/-	6	6
btilis	0	0	0	0	0	0	0	0	6
St. аureus	8	10	8	0	+/-	8	+/-	+/-	9
Ps. aeruginosa	0	0	0	0	0	0	0	0	0
E.coli	0	0	0	0	0	0	0	0	0
C. albicans	0	0	0	0	0	0	13	13	13
Среда II	E. faecium	0	0	0	0	0	0	11	11	12
B. subtilis	+/-	+/-	14	0	0	0	18	19	19
St. аureus	19	19	20	21	22	22	19	20	24
Ps. aeruginosa	0	0	0	0	0	0	0	0	0
E.coli	0	0	0	0	0	0	0	0	0
C. albicans	0	0	0	0	0	0	0	0	0

Полученный из культуральной жидкости микробный экстракт протестировали на антимикробную активность по отношению к S. aureus, btilis и E. faecium. Результаты показали, что в микробном экстракте Flavobacterium sp.28 Bb-06 содержится активное вещество, которое подавляло рост этих тест-культур (рис. 7).