Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (стр. 12 )

Рисунок 7 - Антимикробная активность суммарного микробного экстракта Flavobacterium sp. 28 Bb-06 (контроль – 10% метанол в воде)

Для общей характеристики бактериального экстракта была записана обзорная хроматограмма в градиенте ацетонитрила в воде. Для выявления соединений, обладающих антимикробной активностью, хроматограмма бактериального экстракта была условно разделена на 12 зон различной длительности, каждая из которых была собрана в отдельную пробирку. Фракции были исследованы хроматографически в тех же условиях для оценки качественного и количественного состава и протестированы на антимикробную активность в отношении E. faecium. Обнаружено, что фракция 11,0-12,0 мин практически полностью состоит из соединения со временем удерживания 11,5 мин и обладает значительной антимикробной активностью. Анализ результатов рехроматографии фракций 10,0-11,0 мин; 12,0-13,0 мин и 13,0-14,5 мин показал, что каждая из них содержит в себе соединение со временем удерживания 11,5 мин и их антимикробная активность может быть связана с присутствием этого соединения.

По результатам антимикробной активности фракций и повторной хроматографии (рехроматографии) обнаружено 2 зоны, которые обладают высокой антимикробной активностью (рис. 8).

	Фракции, обладающие антибиотической активностью
	Фракции, не обладающие антибиотической активностью

Рисунок 8 - Антибиотическая активность фракций этилацетатного экстракта Flavobacterium sp.28 Bb-06, перерастворенного в 60% растворе МеОН-Н2О

Тестируемая культура – E. faecium.

По форме и ширине пика можно предполагать, что зона 4,5 - 6 мин состоит из нескольких соединений, а зона 11-12 мин представляет собой гомогенное химическое соединение.

Для характеристики соединения 11,5 мин (зона 11,0-12,0 мин) был записан его УФ-спектр в интервале длин волн от 190 до 360 нм с шагом 2 нм методом остановленного потока (рис. 9).

Из рисунка 9 видно, что один из максимумов поглощения исследуемого вещества, соответствующий максимальной экстинкции в исследуемом интервале длин волн, равен 270 нм. Это может быть связано с присутствием ароматической системы в этом соединении.

Рисунок 9 - Нормированный УФ-спектр для соединения (11,5 мин), полученного из штамма Flavobacterium sp.28 Bb-06. Растворитель МеCN-Н2О=35:65

Методом масс-спектрометрии была определена масса этого соединения, которая составила 594.179, предложена брутто формула: C30H39N3O3Cl3.

Таким образом, среди бактерий, выделенных из озера Байкал, обнаружен штамм Flavobacterium sp.28 Bb-06, обладающий антибактериальной активностью, которая связана с наличием, по меньшей мере, двух соединений. Одно из них выделено в индивидуальном виде и охарактеризовано. Установление структуры этого соединения будет являться предметом наших дальнейших исследований.

Работа выполнена при поддержке грантом РФФИ - Байкал № 05-05-97271 и междисциплинарного проекта СО РАН № 96.

Библиографический список

1.  , , Зайчиков биоразнообразия микробного сообщества водной толщи озера Байкал // Микробиология. – 2003. - Т. 72, № 2. - С. 239-249.

2.  Медицинская микробиология / под ред. , . - М. : ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 1200 с.

3.  Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта и др. - М. : Мир, 1997. - Т. 1, Т. 2. - 368 с.

4.  , , Максимова сообщество пресноводных губок озера Байкал // Известия РАН. Серия Биологическая. – 2008. - № 4. - С. 435-441.

5.  , , Ан активность актиномицетов озера Байкал // Прикладная биохимия и микробиология. – 2006. - Т. 42, № 2. - С. 195-199.

6.  , , Трибой результаты исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов осадков Южного Байкала в районе приповерхностного залегания гидратов метана // Микробиология. – 2005. - Т. 74, № 3. - С. 370-377.

7.  Appelbaum P. C., Jacobs M. R. Recently approved and investigational antibiotics for treatment of severe infections caused by Gram-positive bacteria // Curr. Opin. Microb. – 2005. - Vol. 8. - Р. 510-517.

8.  Gravenitz A. Antimicrobial therapy of infections with aerobic Gram-positive rods // Clin. Microbiol. Infect. – 2001. - Vol. 7. - Р. 41-46.

9.  Johnston L. M., Jaykus L.-A., Antimicrobial resistance of Enterococcus species isolated from produce // Appl. Env. Microb. – 2004. - Vol. 70, № 5. - Р. 3133-3137.

10.  Sponga F., Cavaletti L., Lazzarini A. et al. Biodiversity and potentials of marine-derived microorganisms // J. of Biotechnology. – 1999. - Vol. 70. - Р. 65-69.

11.  Srinivasan V., Nam H-M., Sawant A. A., Headrick S. I., Nguyen L. T., Oliver S. P. Distribution of tetracycline and streptomycin resistance genes and class 1 integrons in Enterobacteriaceae isolated from dairy and nondairy farm soils // Microbial Ecol. - 2007.

Глава 8. ИЗМЕНЧИВОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ LISTERIA MONOCYTOGENES ПОД ДЕЙСТВИЕМ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Среди пищевых инфекций серьезную озабоченность в настоящее время вызывает листериоз. Известно, что Listeria monocytogenes – обладает психрофильными свойствами, что позволяет микроорганизму накапливаться в пищевых продуктах в условиях низкотемпературного хранения, сохраняя и даже повышая вирулентность (Бузолева, 2004). В литературе отсутствуют данные по изучению сочетанного действия вакуума, температуры и вида продукта на изменение биологических свойств листерий. Поэтому целью настоящей работы являлось изучение влияния абиотических (температура, вакуум, вид продукта-субстрата) факторов на размножение и биологические свойства L. monocytogenes при культивировании на пищевых продуктах.

Для эксперимента были взяты продукты, приобретенные в торговой сети г. Владивостока, наиболее эпидемически значимые при листериозе (Тартаковский, 2002): сосиски свиные и сыр «Камамбер», упакованные под вакуум на производстве, креветки вареные. Для лабораторных исследований использовали музейные штаммы L. moпocytogeпes типичные по своим культурально - морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам сероварианта 4b: 132 , 152 , 148. Под парафин стерильным шприцем в асептических условиях вводили по 0,5 мл суспензии листерий в концентрации 109 КОЕ/мл. Срок экспозиции составлял 30 дней, температура культивирования - 6˚С (холодовой вариант) и 22˚С (тепловой вариант). Биологические свойства листерий определяли в соответствии с МУ 4.2.1122-02.

В результате экспериментальных исследований установлено, что действие абиотических факторов приводит к изменению биологических и вирулентных свойств листерий.

Так, тепловые варианты, включая те, которые выращивали в вакууме, независимо от штамма и субстрата, утратили подвижность при 22˚С, в отличие от холодовых вариантов, что подтверждают данные литературы (Сомов, Бузолева, 2004). Из всех холодовых вариантов лишь штамм, культивируемый на креветке, был неподвижен при 22˚С. Возможно, что на подвижность листерий кроме температуры так же влияет и вид продукта, которые они контаминируют.

Все тепловые штаммы утратили гемолитическую и лецитиназную активность. Из холодовых, лишь штаммы, культивируемые на креветке и сыре, не лизировали эритроциты и не продуцировали лецитин.

Показано, что выращивание в вакууме не зависимо от температуры культивирования, усиливало адгезию листерий к эритроцитам. Из холодовых вариантов лишь штамм, культивируемый на креветке, незначительно повысил адгезивность. По данным (2006), в холодных условиях адгезивные свойства у большинства штаммов листерий снижаются. В наших экспериментах в результате сочетанного действия вакуума и низкой температуры на листерии наблюдали повышение их адгезивных свойств.

Каталазная, оксидазная, гиалуронидазная активность, а также тинкториальные свойства и цитопатогенное действие листерий в эксперименте не изменялись.

При изучении сочетанного действия условий вакуума и низкой температуры было показано, что вирулентность L. monocytogenes повышается, при этом значения LD50 уменьшались на два порядка по сравнению с контролем. Во всех остальных вариантах происходило снижение вирулентности, при этом значения LD50 увеличивались на один - два порядка.

Под действием абиотических факторов изменялись биохимические свойства листерий. Характер изменений в большей степени зависел от субстрата и температуры культивирования штаммов. Так, наибольшие изменения (в сторону усиления ферментативной активности) наблюдали у тепловых вариантов, культивируемых на сыре, наименьшие – у холодовых на сосисках. При культивировании на сыре при 22˚С отмечено усиление способности ферментировать сахарозу, мелезидозу, раффинозу, инулин, сорбозу.