Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (стр. 6 )

Органолептические, физико-химические и другие показатели готовых продуктов не отличались от общепринятых.

При переносимости коровьего молока применимы разработанные нами продукт кисломолочный с фукоиданом - «Бифидофукус», каррагинаном - «Бифидокрасный», и с их сочетанием – «Бифидокомплекс». Разработана технология производства (ТУ и ТИ) на эти продукты и подана заявка на патент «Кисломолочный напиток».

Новые кисломолочные продукты, характеризуются, прежде всего, хорошей усвояемостью. Эти продукты оказывают стимулирующее действие на секреторную активность пищеварительных желез; способствуют нормализации перистальтики кишечника за счет молочной кислоты; способствуют улучшению всасывания микроэлементов (P, Ca, Fe); оказывают гипохолестеринемический эффект; способствуют сорбции и выведению тяжелых металлов.

В) Иммуномодулирующий эффект, обусловленный самим пробиотиком, как природным иммуномодулятором, а также полезные эффекты, обусловленные биологической активностью того или иного БАВ.

Помимо того, что восстановление нормальной микрофлоры кишечника приводит к реализации последней (ею) иммуномодулирующего действия, БАВ оказывают свои полезные, в том числе иммуномодулирующие эффекты.

Г) Показания (рекомендации) к применению новых продуктов

Полученные новые бифидопродукты рекомендованы для систематического применения и могут быть отнесены к категории продуктов функционального питания у взрослых. Спектр показаний к их применению довольно широк: дисбактериозы кишечника, кишечные инфекции, колиты, интоксикации различного происхождения, длительное применение антибиотиков, радиационное облучение, стрессы. Показано применение новых продуктов с профилактической целью при нервно-эмоциональном напряжении, повышенных физических и интеллектуальных нагрузках.

Новые продукты перспективны для эффективной профилактики многих заболеваний (ОРЗ, гриппа, кишечных инфекций и др.), для детоксикации организма, для восстановления после стрессовых ситуаций, во время и после курса антибактериальной, гормональной, лучевой терапии.

, ,

,

Глава 3. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ИЗУЧЕНИИ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ

ЛОСОСЕВИДНЫХ РЫБ ОЗЕРА БАЙКАЛ: ПРОБЛЕМЫ И РЕШЕНИЯ

Введение

В настоящее время технология разведения рыб в аквакультуре во многих странах превратилась в одну из наиболее быстропрогрессирующих отраслей производства продовольствия. Российская Федерация по наличию водоемов, отвечающих требованиям культивирования гидробионтов, занимает первое место в мире (Богерук, 2005). Современное развитие аквакультуры, как и всего агропромышленного комплекса, во многом определяется применением в производстве инноваций, базирующихся на использовании научно-технических разработок (Богерук, 2005). Решение острых проблем, выведение рыбной отрасли из многолетнего системного кризиса и достижение поставленной цели возможно только на основе инновационного пути развития экономики рыбохозяйственного комплекса. В настоящее время в нашей стране в разных секторах аквакультуры появляются эффективно работающие рыбоводные хозяйства, в основе деятельности которых лежат инновационные решения, базирующиеся на применении прогрессивных биотехнологий.

При разведении рыб, как в естественных, так и в искусственных водоемах, одной из серьезных проблем является изменение трофности водной среды и образование токсичных соединений, вызванных увеличением продуктов животного метаболизма. В этих условиях преимущество для роста и развития получают сапрофитные микроорганизмы, происходит распространение бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, что ведет к повышенной смертности объектов культивирования. В рыбоводных хозяйствах широко распространены бактериальные заболевания, объединенные термином "краснуха" карпов: аэромоноз, псевдомоноз, бактериальная геморрагическая септицемия, смешанные бактериальные инфекции (Грищенко и др., 1999; Buller, 2004). Исследования микрофлоры рыб необходимы для контроля и коррекции их питания, для научного обеспечения контроля показателей качества и безопасности сырья и готовой продукции, а также для изучения патогенных бактерий и факторов, способствующих профилактике инфекционных заболеваний (Абрамова, 2004; Извекова и др., 2007; Кириченко и др., 2004; Кузьмина, 2005; Austin, 2002; Buller, 2004).

Использование новых, современных технологий в профилактике и терапии заболеваний рыб позволит существенно снизить экономические потери, вызванные массовой гибелью их от инфекционных заболеваний. Молекулярно-генетические методы становятся надежным и удобным инструментом для решения многих прикладных задач в данной области. Методы диагностики бактериальных инфекций на основе видоспецифичной амплификации (ПЦР-диагностика) – современные наукоемкие технологии – показали свое преимущество перед классическими микробиологическими методами детекции и идентификации бактериальных заболеваний рыб: они требуют меньше времени для получения результата и эффективны для детекции заболеваний, особенно на ранних стадиях. ПЦР-диагностика бактериальных инфекций позволяет корректно идентифицировать возбудителей тех болезней, культивирование и определение которых по классическим биохимическим тестам затруднительно. Этот метод активно используется в странах с развитой аквакультурой (Норвегия, Канада и др.), постоянно совершенствуется и развивается (Buller, 2004; Haygood et al., 1992; Haygood, 1993; Van der Maarel et al., 1999; Spanggaard et al., 2000). В настоящее время подобраны специфичные праймеры на патогенные микроорганизмы таких родов, как Aeromonas, Lactococcus, Flavobacterium и др. (Buller, 2004).

Известно, что бактериальные клетки имеют различный физиологический статус: живые; жизнеспособные, но некультивируемые; резистентные – споры; мертвые. Определение жизнеспособности клеток имеет принципиальное значение в таких областях использования ПЦР-методологии, как пищевая микробиология (учет активных бактериальных клеток в продуктах питания), медицинская и ветеринарная микробиология. Для детекции живых клеток применяют ОТ-ПЦР и мРНК (Novak, Juneja, 2001; Bentsink et al., 2002), однако возникают определенные трудности, как с воспроизводимостью результатов такого анализа, так и с корректной дифференцировкой живых и мертвых клеток при использовании мРНК в качестве маркерных молекул (McKillip et al., 1998; Sheridan et al., 1998). Другое направление исследований связано с применением методов микроскопии и проточной цитометрии с красителями, позволяющими различать живые и мертвые клетки, такие как Syto 9 или BacLight (Michel et al., 1999; Burnett, Beuchat, 2002; Rudi et al., 2005). Однако в данном случае чувствительность метода существенно ниже, чем ПЦР или подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) (Rudi et al., 2005). Поэтому разработка методологии, позволяющей использовать ПЦР для дифференциации ДНК из живых и мертвых бактериальных клеток, позволит полностью использовать потенциал ПЦР-методологии в микробной диагностике (Lee, Levin, 2009). В настоящее время в мировой научной литературе обсуждаются результаты лабораторных экспериментов по селективному различению ДНК из живых и мертвых бактериальных клеток с помощью производных этидиумбромида (Flekna et al., 2007; Lee, Levin, 2007, 2009; Nocker et al., 2009). Мы сочли, что использование производных этидиумбромида для ингибирования ДНК из мертвых клеток перед проведением ПЦР является наиболее перспективным методом.

Цель работы – разработка эффективной методики, позволяющей быстро и корректно детектировать бактериальные инфекции рыб в условиях искусственного содержания с учетом селективной детекции живых и жизнеспособных бактериальных клеток на основе специфичного ингибирования внеклеточной ДНК.

Материалы и методы

Пробы биологического материала отбирали в карантинном и экспозиционном аквариумах Байкальского музея ИНЦ СО РАН. Исследования выполнены на следующих видах байкальских рыб:

а) черный байкальский хариус (Thymallus baicalensis): три здоровых особи и рыба со слизистыми обрастаниями на внешних покровах, анализировали образцы соскобов около головы, спинного плавника и по боковой линии;

б) ленок (Brachymystax lenok): две особи с язвами на внешних покровах, анализировали ежедневные образцы соскобов слизи в месте язвенных кровотечений в течение 7 дней;

в) байкальский сиг (Coregonus lavaretus baicalensis): две особи с язвами на внешних покровах, анализировали ежедневные образцы соскобов слизи в месте язвенных кровотечений в течение 7 дней;

г) байкальский омуль (Coregonus migratorius): пять внешне здоровых особей, анализировали образцы переднего, среднего и заднего отделов кишечника, соскобов около головы, спинного плавника, по боковой линии.

Все образцы отбирали в двух повторностях и подвергали первичной обработке: либо добавление трис-солевого буфера (ТСБ) и использование сразу же для выделения тотальной ДНК, либо суспендирование биологического материала в ТСБ и обработка моноазидом этидиумбромида.

Отбор биологического материала и первичная обработка проб. Образцы тканей рыб собирали стерильным скальпелем в пробирки эппендорф и добавляли от 100 мкл до 1 мл трис-солевого буфера в зависимости от объема биологического материала (ТСБ: 10 мМ трис-HCl, pH 7,5; 0,1 M NaCl; 2 мМ ЭДТА). Проводили серию экспериментов по определению оптимальных условий первичной обработки бактериального материала: 1) суспензию биологического материала использовали без фиксации для выделения тотальной ДНК и фиксировали этанолом до конечной концентрации 70%; 2) лизис биологического материала с добавлением понижающих концентраций анавидина (табл. 3) и 3) обработка биологического материала моноазидом этидиум бромида (ЕМА) для удаления внеклеточной ДНК. Для этого к 100 мкл суспензии добавляли 2 мкл ЕМА (50 мг/мл), инкубировали во льду 1 мин при освещении 650 вт. Выдерживали в темноте 20 мин и использовали для выделения тотальной ДНК. Эксперименты выполнены в трех повторностях.

Таблица 3 - Схема эксперимента по возможности использования раствора анавидина в качестве лизирующего агента для разрушения бактериальных клеток и последующего выделения суммарных нуклеиновых кислот, пригодных для амплификации