Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (стр. 7 )

Концентрация анавидина	Дополнительный лизирующий агент	Результаты амплификации
0,01% Ана 1*	–	–
0,02% Ана 1	–	–
0,05% Ана 1	–	–
0,1% Ана 1	–	–
0,01% Ана 1	1% SDS	++
0,02% Ана 1	1% SDS	++
0,05% Ана 1	1% SDS	+
0,1% Ана 1	1% SDS	–
0,01% Ана 2**	–	+
0,02% Ана 2	–	–
0,05% Ана 2	–	–
0,1% Ана 2	–	–
0,01% Ана 2	1% SDS	++
0,02% Ана 2	1% SDS	++
0,05% Ана 2	1% SDS	++
0,1% Ана 2	1% SDS	–
–	1% SDS	–
–	Ферментативный лизис	++

Примечания:

* - Анавидин товарный продукт (бочка)

** - Анавидин с запахом лесных трав (№ партии 16-07 МК-6)

Интерпретация результатов амплификации:

– ПЦР-продукт не был получен

++ получено два ПЦР-продукта как специфический бактериальный, так и неспецифический с ДНК рыбы

+ получен только неспецифический ПЦР-продукт с ДНК рыбы

Выделение ДНК методом ферментативного лизиса проводили с пробами без предварительной обработки, фиксированными 70% этанолом и после обработки ЕМА. Для выделения тотальной ДНК к 100 мкл пробы с биологическим материалом добавляли 300 мкл ТСБ с лизоцимом (10 мкг/мл), лизис проводили в течение 60 мин при 37°С (Белькова и др., 2008). Затем добавляли 25 мкл протеиназы К (10 мг/мл), инкубировали 30 мин при 60°С. Для денатурации белков добавляли 40 мкл 10% SDS и выдерживали 10 мин при комнатной температуре. Проводили три стадии замораживания-оттаивания. Белки и остатки клеточных стенок удаляли фенол-хлороформной экстракцией. К водной фазе добавляли 1/10 объема 3M ацетата натрия (pH 5,0) и 2 объема абсолютного этанола. ДНК осаждали в течение ночи при –20°С, собирали центрифугированием на настольной центрифуге на максимальных оборотах 30 мин (12000 об/мин). Для удаления солей осадок промывали 400 мкл 70% холодного этанола, затем его подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера (ТЕ: 10 мМ трис-HCl, pH 7,5; 1 мМ ЭДТА).

Выделение ДНК из проб после эксперимента с анавидином проводили с помощью сорбента. Обработку лизирующими растворами проводили, как описано в таблице 3. Пробы прогревали 10 мин при 60°С, центрифугировали 15 мин на настольной центрифуге (12000 об/мин), надосадочную жидкость переносили в новую пробирку. К прозрачному лизату добавляли 25 мкл сорбента. Суспензию тщательно суспендировали на вортексе, выдерживали при комнатной температуре 5 мин, периодически перемешивая. Центрифугировали 30 сек при 12000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок промывали 400 мкл 70% этанола и подсушивали 30 мин при 60°С. Нуклеиновые кислоты элюировали в 25 мкл ТЕ буфера. Для этого осадок тщательно суспендировали, прогревали в термостате 5 мин при 60°С и центрифугировали 5 мин на настольной центрифуге на максимальных оборотах (12000 об/мин). Надосадочную жидкость тщательно, без сорбента отбирали в новую пробирку и использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция. Выделенную суммарную ДНК использовали в качестве матрицы в ПЦР и подбирали режим, обеспечивающий высокое качество ПЦР-продукта ожидаемой длины на праймерах, комплементарных участкам гена 16S рРНК бактерий с разным уровнем специфичности (табл. 4). Амплификацию вели в разных условиях, в том числе проверяли температуру отжига в градиенте температур от 44 до 72°С в амплификаторе DNA Engine DYADTM. Анализ продуктов амплификации проводили разделением фрагментов ДНК в 1,5% агарозном геле.

Таблица 4 - Структуры праймеров, использованных в работе (Белькова, Андреева, 2009)

Название праймера	Структура 5’–3’	Детектируемая филогенетическая группа
Консервативные праймеры
21L	TTCCGGTTGATCCYGCCGGA	Архебактерии
109L	ACKGCTCAGTAACACGT	Архебактерии
333L	TCCAGGCCCTACGGG	Архебактерии
344L	ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA	Архебактерии
915R	GTGCTCCCCCGCCAATTCCT	Архебактерии
958R	YCCGGCGTTGAMTCCAATT	Архебактерии
1492R	GGCTACCTTGTTACGACTT	Архебактерии
500L	CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA	Эубактерии
1350R	GACGGGCGGTGTGTACAAG	Эубактерии
338L	ACTCCTACGGGAGGCAGCAG	Эубактерии
500R	TTACCGCGGCTGCTGGFACG	Эубактерии
NS8	TCCGCAGGTTCACCTACGGA	Эукариоты
Групп-специфичные праймеры
35L	CTGGCTCAGAYCGAACG	Альфа-протеобактерии
681L	AGTGTAGAGGTGAAATT	Альфа-протеобактерии
663L	GAATTCCATCCCCCTCT	Бета-протеобактерии
680L	CRCGTGTAGCAGTGA	Бета-протеобактерии
319L	GTACTGAGACACGGACCA	Цитофаги-Флавобактерии
342L	CAGCAGTAGGGAATCTTC	Бациллы
31L	GATCCTGGCTCAGAATC	Ацидобактерии
235L	CGCGGCCTATCAGCTTGTTG	Актинобактерии
930R	CTCCACCGCTTGTGTGA	Планктомицеты
NS1	GTAGTCATATGCTTGTCTC	Saprolegniaceae
Видо-специфичные праймеры
АН-F	GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA	Aeromonas hydrophila
AH-R	CGTGCTGGCAACAAAGGCCAG	Aeromonas hydrophila
PAF	GACCTCGCGCCATTA	Pseudomonas anguilliseptica
PAR	CTCAGCAGTTTTGAAAG	Pseudomonas anguilliseptica
BF1	TCACCAAGGCRACGATGCG	Bacillus licheniformis
BR2	CGTATTCACCGCGGCATG	Bacillus licheniformis
650L	TAGAGTATGGGAGAGGAT	Acinetobacter calcoaceticus

Амплификацию с лизатами клонов после клонирования проводили на плазмидных праймерах, рекомендованных фирмой производителем и поставляемых в наборе для клонирования (GeneJETTM PCR Cloning Kit, Fermentas). В амплификацию брали 1 мкл лизата. Режим реакции:

94°С – 5 мин (1 цикл),

92°С – 45 сек, 55°С – 45 сек, 72°С – 45 сек (30 циклов).

После амплификации ПЦР-продукты анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле в ТА буфере (2 мМ трис-ацетат, рН 7,6). Полосы нужной длины вырезали из геля. ПЦР-продукты элюировали замораживанием-оттаиванием и использовали для секвенирования.

Лигирование ПЦР-продукта и трансформация клеток Escherichia coli. Для лигирования использовали набор GeneJETTM PCR Cloning Kit (Fermentas). Реакцию проводили по рекомендации фирмы-производителя. Компетентные клетки E. coli (штамм XL-1) для трансформации получали, используя методику трансформации CaCl2-зависимых клеток (Sambrook et al., 1989). Анализировали все выросшие колонии. Для быстрого скрининга большого числа колоний использовали метод «кипячения» клеток. Лизат клеток после центрифугирования (15 мин, 12000 об/мин) использовали в качестве матрицы в ПЦР на плазмидных праймерах.

Сравнительный анализ. Анализ полученных последовательностей проводили путем их сравнения с последовательностями, зарегистрированными в международной базе данных с помощью пакета программ FASTA (http://www. ebi. ac. uk/fasta33). Наличие химерных структур определяли анализом последовательностей с имеющейся базой данных с помощью пакета программ CHECK CHIMERA (http://rdp8.cme. msu. edu/html/analyses. html).

Результаты и обсуждение

Для разработки эффективной методики, позволяющей быстро и корректно детектировать бактериальные инфекции рыб, необходимо оценить разные подходы для фиксации бактериального материала и выделения тотальной ДНК. Нами для фиксации и лизиса бактериальных клеток были использованы как классические процедуры: фиксация этанолом и выделение ДНК методом ферментативного лизиса, так и апробирована возможность использования новых химических реагентов, лизирующих клеточные стенки бактерий и денатурирующих внутриклеточные белки. Разработка эффективной методики предполагает поиск оптимальных реагентов и условий лизиса в максимально сжатые сроки. Для этой цели нами впервые эффективный антисептик – анавидин, разработанный на основе производных гуанидина в Иркутском институте химии СО РАН (патент РФ N2144024), был использован в качестве реагента, лизирующего клеточные стенки бактерий. Качество полученной ДНК проверяли ПЦР на консервативных бактериальных праймерах (табл. 4). Положительным считали наличие хотя бы одного ПЦР-продукта. Установлено, что оптимальной для лизиса клеток является концентрация анавидина 0,01% и добавление додецилсульфата натрия до конечной концентрации 1% (рис. 1). Таким образом, нами показано, что при низких концентрациях анавидин является эффективным лизирующим реагентом и на его основе возможно создание нового набора для выделения тотальной ДНК.