Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии» (стр. 15 )

Более удобным способом выявления клеток с измененным хромосомным набором (как с увеличенным в ходе полиплоидизации, так и с уменьшенным в ходе апоптоза) является метод проточной цитофотометрии. Этот метод позволяет произвести очень быстрый и точный анализ содержания ДНК в большом количестве образцов гемолимфы или других тканей. Проточная цитофотометрия опирается на измерения свойств клеток в «проточной системе», состоящей из специальным образом создаваемого потока жидкости, в который вводят клетки. В момент, когда клетки проходят через луч лазера, они рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции. Для выявления анеуплоидных или полиплоидных клеток используют количественные флуоресцентные окраски на ДНК (DAPI, PI, ЕВ Хёхст и др.). Поскольку содержание ДНК в клетках меняется по ходу клеточного цикла (перед делением клетки оно удваивается), метод позволяет также выявить долю клеток на разных стадиях цикла, а также суммарный процент клеток, участвующих в данный момент в пролиферации. Если на однопараметрической гистограмме выявляется нетипично большой пик тетраплоидных клеток (больше ожидаемого числа нормальных предмитотических (G2) и митотических (М) клеток) или регистрируются клетки других классов плоидности, подозревают наличие в исследуемой ткани опухолевой трансформации (Bihari et al., 2003; da Silva et al., 2005).

Если образцы одновременно окрашены на ДНК и на какие-либо специфические антигены (маркеры) клеточной пролиферации, то двумерные гистограммы позволяют анализировать динамику клеточного цикла и оценивать различные его параметры – такие как скорость деления клеток, время удвоения популяции опухолевых клеток, границы между фазами цикла и т. д. Так, для устрицы Crassostrea virginica при одновременном анализе содержания ДНК методом проточной цитофлуорометрии и иммуноцитохимическом определении экспрессии PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) на препаратах было показано, что клетки ротовой лопасти обладают более высокой пролиферативной активностью по сравнению с клетками других органов – мантии, жабер, глотки и пищеварительной железы (Jenkins et al., 2006). Подобные исследования позволяют отбирать определенные клеточные линии для использования показателя пролиферативной активности в качестве биомаркера при изучении воздействий стрессовых факторов на морские организмы.

Работа поддержана Государственным контрактом с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.740.11.0292.

Библиографический список

1.  Bihari N., Micic M., Batel R., Zahn R. K. Flow cytometric detection of DNA cell cycle alterations in hemocytes of mussels (Mytilus galloprovincialis) off the Adriatic coast, Croatia // Aquatic Toxicology. - 2003. - Vol. 64. - P. 121-129.

2.  Da Silva P. M., Soudant P., Carballal M. J., Lambert C., Villalba A. Flow cytometric DNA content analysis of neoplastic cells in haemolymph of the cockle Ceratoderma edule // Diseases of Aquatic Organisms. - 2005. - Vol. 67. - P. 133-139.

3.  Galimany E., Sunila I. Several cases of disseminated neoplasia in mussels Mytilus edulis (L.) in Western Long Island Sound // Journal of Shellfish Research. - 2008. - Vol. 27, № 5. - Р. 1201-1207.

4.  Jenkins J. A., LaPeyre J. F. Cell proliferation detected with flow cytometric cell cycle analysis and immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) from somatic tissues of eastern oysters, Crassostrea virginica // Environmental Bioindicators. -2006. - Vol. 1, № 3. - Р. 177-190.

5.  Usheva L. N., Odintsova N. A. Mesenchymal tumor in the mantle of the mussel Modiolus difficilis from Amursky Bay in the Sea of Japan // Diseases of Aquatic Organsms. - 1997. - Vol. 29. - P. 121-126.

6.  Usheva L. N., Frolova L. T. Neoplasia in the connective tissue of the mussel Mytilus trossulus from polluted areas of Nakhodka Bay, Sea of Japan // Russian Journal of Developmental Biology. - 2000. - Vol. 31, № 1. - Р. 53-60.

, ,

Глава 14. Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмов-возбудителей инфекций респираторного тракта

Несмотря на достигнутые успехи, диагностика инфекций респираторного тракта до сих пор остается одной из наиболее значимых проблем здравоохранения. Во многом это связано как с отсутствием адекватных методов диагностики и идентификации возбудителей, так и с объективными причинами, такими как многообразие видового состава и принадлежность рассматриваемых микроорганизмов к группе прихотливых возбудителей.

Целью нашей работы являлось на примере Streptococcus pneumoniae, наиболее часто встречающегося патогена респираторного тракта, обосновать новый метод идентификации и генотипирования микроорганизмов - возбудителей инфекций респираторного тракта.

Методы: В качестве перспективного диагностического и молекулярно-эпидемиологического маркера штаммов S. pneumoniae изучен некодирующий участок ДНК SP_1922 и SP_1923, обозначенный как NCR (non-coding region). Охарактеризованы такие молекулярно-генетические особенности этого участка, как: фланкированность видоспецифичным геном (ген ply), приемлемый размер ампликона; а также наличие статистически значимой вариабельности рестрицируемых фрагментов.

Результаты: несмотря на значимость пневмококковых инфекций эпидемическая ситуация в отношении данной инфекции обусловлена во многом объективной сложностью микробиологической диагностики S. pneumoniae, не позволяющей до настоящего времени создать так называемый «золотой» стандарт диагностики, а также проводить мониторинг пневмококковых инфекций. Для решения данной задачи был применен метод анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae, где в качестве диагностической мишени был использован некодирующий фрагмент геномной ДНК S. pneumoniae, ранее не применявшийся в таком качестве.

Некодирующий фрагмент (NCR) геномной ДНК S. pneumoniae является видоспецифичным участком и обладает свойствами, объясняющими его использование в качестве оптимальной диагностической мишени для диагностики пневмококка, в связи с техническими преимуществами выполнения полимеразной цепной реакции, которые не были достигнуты при использовании других участков генома S. pneumoniae, такие как локализация изучаемого фрагмента в непосредственной близости от гена, кодирующего видоспецифический фактор вирулентности пневмококка - пневмолизин; консервативность фланкирующих их участков (SP1922 (гипотетический протеин) и SP1923 (пневмолизин)); наиболее приемлемый размер (1182 bp) выбранного ампликона; амплификация вариабельного участка генома.

В связи с применением для создания праймера новой диагностической мишени была изменена схема ПЦР реакции для оптимизации параметров ренатурации с целью увеличения выхода конечного ПЦР-продукта. В частности, мы пришли к выводу, что оптимальным числом циклов, обеспечивающих максимально возможный выход амплифицированного продукта, является 30; другие параметры не нуждались в оптимизации и были проведены согласно общепринятым правилам.

В результате серии проведенных опытов с использованием предложенного нами варианта ПЦР реакции праймер, созданный на основе последовательности NCR фрагмента, действительно оказался высокочувствительным и высокоспецифичным видовым маркером. Реакция была положительна как с контрольными, так и с референтными штаммами (R6, TIGR4), и она была отрицательна с близкородственными штаммами семейства стрептокококков, а также была отрицательна со штаммами, неродственными S. pneumoniae, но наиболее часто выделяемыми вместе с ним в составе ассоциаций микроорганизмов из клинических образцов.

Кроме того, чувствительность NCR фрагмента S.  pneumoniae не связана с серотиповой принадлежностью выделенного штамма. Проведенный количественный анализ ПЦР продукта показал отсутствие взаимосвязи, и вне зависимости от серотипа средний размер амплифицированного фрагмента составлял 1268 ± 6,57 пар оснований [1254,997-1281,603].

Выводы: в качестве перспективного диагностического и молекулярно-эпидемиологического маркера штаммов S. pneumoniae изучен некодирующий участок ДНК SP_1922 и SP_1923, обозначенный как NCR (non-coding region). Охарактеризованы такие молекулярно-генетические особенности этого участка, как: фланкированность видоспецифичным геном (ген ply), приемлемый размер ампликона; а также наличие статистически значимой вариабельности рестрицируемых фрагментов.

___________________________________________________________________________

Раздел II

БИОТЕХНОЛОГИИ

КАК ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ РЕСУРС

___________________________________________________________________________

Глава 1. Инновационные технологии в производстве пищевых продуктов из сои. Использование соевых продуктов в медицине

Для населения стран Азии продукты из сои – традиционный продукт питания, с употреблением которого восточные народы связывают низкую частоту распространения ряда болезней. Традиционные восточные соевые продукты малоприемлемы для европейцев вследствие наличия специфических вкуса и запаха. С целью улучшения вкусовых качеств продуктов из сои на Западе были разработаны новые инновационные технологии производства текстуратов и изолятов соевого белка, вакуумная дезодорация соевого масла и других соевых продуктов. Сегодня в США и странах Европы на прилавках магазинах широко представлены соевые молоко, напитки, мороженое йогурты, причем на рынке эти продукты позиционируются как продукты здоровья. В 90-е годы в России отмечался всплеск интереса к продуктам из сои. На Дальнем Востоке и других регионах была освоено производства ряда соево-молочных продуктов. Однако, к настоящему времени интерес населения к этим продуктам снизился, а их производство постепенно сходит на нет. В значительной мере это связано с использованием производителями достаточно примитивных технологий. Лишь единичные предприятия, например Комсомольский городской молочный завод (ДАКГОМЗ), имеют высокотехнологичные линии, позволяющие производить дезодорированные продукты. За рубежом проводятся исследования, направленные на выяснение возможности профилактики и лечения ряда болезней с помощью употребления в пищу соевых продуктов. Несмотря на очевидную практическую пользу от широко внедрения продуктов из сои в рацион питания населения, в нашей стране выполняются лишь единичные подобные исследования. Решение проблемы соевого питания в России возможно только лишь на основе внедрения новых инновационных технологий производства этих продуктов, широкой пропаганды среди населения соевых продуктов как продуктов здоровья, проведения научных исследований, показывающих пользу соевого питания для Россиян. Еще одна область, в которой благодаря использованию инновационных технологий (нанотехнологий), достигнут определенный успех это производство лекарств из компонентов сои. В 80-ые годы я участвовал в разработке лекарственного препарата для лечения заболеваний кровеносных сосудов на основе фосфолипидов сои. Исследования проводились в Московском медицинском университете. Нами было установлено, что наиболее эффективной формой фосфолипидного препарата для удаления избыточного холестерина из плазматических мембран клеток являются мелкие положительно заряженные мицеллы. Однако, предложенный препарат был нестабилен при хранении и поэтому не мог быть внедрен в производство. Лишь несколько лет спустя в Институте биологической и медицинской химии РАМН был зарегистрирован препарат «Фосфоглив», представляющий лиофилизированные нанолипосомы. Еще один лекарственный препарат, над разработкой которого мы сейчас работаем, может быть создан на основе соевого ингибитора трипсина, причем этот препарат может найти применение не только в медицине, но и как консервант, позволяющий предохранять белки от разрушения протеолитическими ферментами. Таким образом, проблема использования потенциала сои подразумевает широкое внедрение инновационных технологий производства соевых пищевых продуктов и создания лекарственных средств на основе компонентов сои. Без сомнения, инновационный характер имело бы приобщение Россиян к соевым продуктам. Ниже речь пойдет о имеющемся у нас опыте использования соевых продуктов в медицинских целях.