Микробиология и вирусология (стр. 17 )

Биохимические свойства выражены слабо. Бактерии продуцируют каталазу, штаммы, выделенные от овец, слабо образуют сероводород, не ферментируют углеводы.

Биопроба. Заражают беременных морских свинок внутрибрюшинно, или во влагалище с последующим исследованием абортированных плодов. Если в течении 12 дней аборта не наступит, морских свинок убивают и исследуют плоды и содержимое полости матки. При необходимости биопробу ставят на беременных телках и овцах — заражают подкожно или орально. Животные не погибают, они абортируют или их убивают (при отсутствии аборта).

Серологическая диагностика. Антигенное строение кампилобактера изучено недостаточно. Установлен тот факт, что антигенное строение штаммов, выделенных от крупного рогатого скота и овец, отличаются друг от друга. Различают четыре ти­па, но бычьи относят еще к пятому серологическому типу; так, Camp. fetus subsp. fetus обозначают как серовар 1, С. fetus subsp. intestinalis — серовар 2. Антигенное строение имеет значение для серологической диагностики и в биологической про­мышленности для получения (производства) диагностических сывороток. С диагностической целью применяют три серологических метода — РА, РСК (РДСК) и метод флуоресцирующих антител (МФА).

Для РА в лабораторию направляют пробы влагалищной слизи от телок, ис­пользованных для биопробы, от коров с расстройством полового цикла. Слизь берут марлевым тампоном в период полового покоя животного, готовят вытяжку, фильтруют, разводят 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200, 1 : 400. Предварительно для получе­ния вытяжки (экстракта) слизи с тампона последний помещают в пробирку с 5 мл стерильного формалинизированного 3 %-ного раствора NaCl, выдерживают 12 — 14 часов при +1- 4 °С, тампон отжимают пинцетом, жидкость центрифугируют 30 минут при 2,5- 3 тыс. об/мин. РА ставят в пробирках с влагалищной слизью в четырех разведениях. В пробирки первую и вторую наливают по 0,5 мл исходного экстракта слизи, во вторую, третью и четвертую — предварительно наливают по 0,5 мл формали­низированного 3 %-ного NaCl. Из второй пробирки переносят в третью 0,5 мл, из третьей — в четвертую. Из последней 0,5 мл удаляют в сосуд с дез. раствором. В каждую пробирку добавляют по 0,5 мл (1 млрд) взвеси антигена. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при +37 °С на 24 часа, дополнительно вы­держивают 3—6 часа при комнатной температуре, затем учитывают результат.

Наряду с исследуемыми пробами материала обязательно ставят контроли: 1) контроль антигена (проверка самоагглютинации): в пробирку наливают 0,5 мл антигена в рабочем разведении и добавляют 0,5 мл 3 %-ного раствора NaCl; 2) контроль активности антигена: в каждую пробирку с разведенной агглютини­рующей сывороткой первого типа (1 : 50—1 : 400) добавляют по 0,5 мл антигена; 3) контроль специфичности антигена: в две пробирки по 0,5 мл нормальной сы воротки в разведениях 1 : 100 и 1 : 200 добавляют по 0,5 мл антигена. Все про­бирки встряхивают и далее поступают с ними так же, как с опытными.

Учет результатов начинают с контролем антигенов. Отрицательная реакция в первом и третьем контролях (при положительной во втором) свидетельствует о правильности постановки реакции и специфичности антигена (кампилобактерийный антиген представляет собой 10 млрд/мл взвесь кампилобактерий, убитых формалином). Перед употреблением его встряхивают, разводят 3 %-ным раство­ром NaCl, содержащим 0,3 % формалина 1:10.

У больных овец (абортировавших) для исследования берут сыворотку кро­ви (свежую или консервированную борной кислотой). Помимо РА, сыворотку животных исследуют также методами РДСК или иммунофлуоресценции.

Контрольные вопросы:

1. Патологический материал, направляемый в лабораторию, и его бактериологи­ческое

исследование.

2. Латинское название возбудителя кампилобактериоза (вибриоза), его морфоло­гические и

культуральные особенности.

3. Питательные среды, применяемые для культивирования С. fetus.

4. Методы серологической диагностики кампилобактериоза.

1.14 Тема: Возбудитель лептоспироза

Цель занятия: Ознакомить студентов с правилами взятия пат. материала, его пере­сылки в лабораторию и с методами бактериологического и серологического ис­следования при диагностике лептоспироза. Обучить методике микроскопирования в темном поле, методике постановки реакции микро - и макроагглютинации.

Задание:

1. Приготовить препарат с раздавленной каплей из чистой культуры лептоспир.

2. Просмотреть под микроскопом в темном поле микроскопа.

3. Микрокартину зарисовать.

4. Поставить реакцию микроагглютинации.

Материалы и оборудование: Пробирки с чистой культурой лептоспир, стекла предметные и покровные чистые и обезжиренные, стерильные пастеровские пи­петки (одна пачка), пипетки мерные (стерильные, на 1 мл 2 пипетки), резиновые груши, спирт, микроскоп с темнопольным конденсором и осветителем ОИ-17, пробирка с дистиллированной (стерильной) водой — 5 мл, пластины из плекси­гласа с луночками (или чистые пробирки и штативы к ним), лептоспирозные агг­лютинирующие сыворотки (две ампулы двух различных серогрупп лептоспир, пробирка стерильного физраствора, антигены для диагностики лептоспироза, ре­акцией микроагглютинации). Для демонстрации необходимы таблицы, пробирки с культурой лептослир (например, L. biflexa), чашки Петри с агаровой культурой лептоспир два готовых препарата-мазка (один — из культуры лептоспир, окрашенный методом Романовского — Гимзы, другой мазок — обработанный для лю­минесцентной микроскопии). МЛ-2, нефлуоресцирующее масло, биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 1, спирохеты;

Порядок – Spirochaetales (м/о, состоящие из осевой нити, вокруг которой спиралеобразно

закручена цитоплазма. Подвижны.);

Семейство – Spirochetaceae;

Род – Leptospira;

Виды – L. interrogans, L. biflexa.

Среди лептоспир различают две группы — патогенные для животных и человека (L. interrogans) и непатогенные (L. biflexa). У патогенных лептоспир выделено 25 се­рологических групп, более 180 серовариантов (сероваров). Основными возбуди­телями лептоспироза считают лептоспиры серогрупп батавие, гебдомадис, гриппотифоза, иктерогеморрагие, каникола, помона, тарассови. Лептоспироз – инфекционное заболевание разных видов животных, болеет и человек. Заболевание характе­ризуется кратковременной лихорадкой, острым и подострым течением болезни, нередко с гемоглобинурией (особенно у телят), анемией, желтушностью, атонией желудочно-кишечного тракта, истощением. Переболевшие животные длительное время остаются лептоспироносителями и лептоспировыделителями. Следует учи­тывать, что у коров и свиноматок лептоспироз может проявляться абортами.

Патологический материал направляют в лабораторию при жизни животно­го и посмертно. При жизни животного отправляют кровь 5 мл для бактериологи­ческого исследования в период лихорадки и 5—10 мл для серологического иссле­дования, обязательно нужно брать пробу крови от абортировавшего животного. Мочу собирают в стерильные емкости во время естественного мочеиспускания утром (до кормления). Абортированный плод посылают целиком или его желу­док с содержимым (перевязанный с двух сторон), паренхиматозные органы плода (отдельно от желудка). Посмертно от крупных животных посылают сердце с пе­ревязанными сосудами, кусочки паренхиматозных органов, почку, лучше цели­ком (если кусочки, то стараются сохранить корковый слой), транссудат грудной и брюшной полостей, мочевой пузырь с содержимым (перевязанный лигатурой), спинномозговую жидкость. Трупы мелких животных посылают целиком.

Помимо материала от больных (и павших) животных, в лабораторию могут быть направлены для исследования пробы воды (редко корм, навоз). Пробу воды объемом 1—2 л из водоема.

В лаборатории присланный материал положено исследовать в течение 6 ча­сов с момента отбора проб (или гибели животного) и 10—12 часов — при хране­нии его в охлажденном состоянии, мочу — в течение 3 часов (то есть сроки вы­живания лептоспир в данных условиях). Лептоспироз диагностируют бактериоло­гическим, серологическим и гистологическим методами.

Для бактериологического исследования предварительно материал следует подготовить: мочу — центрифугируют (при 10—15 тыс об/мин 30 минут) и ис­следуют осадок и надосадочную жидкость; кровь (цитратную) отстаивают, иссле­дуют плазму; из проб органов готовят суспензию в стерильном физрастворе, ис­следуют в нативном состоянии или после центрифугирования.

Микроскопия. Лептоспиры плохо воспринимают окраску. Их исследуют ме­тодом раздавленной капли (не менее трех мазков) при темнопольном конденсоре (объек­тив х20, Х40). Морфологически лептоспиры характеризуются спиралеобраз­ной формой, это прямые или S-образные тонкие светящиеся в темном поле подчужные нитевидные организмы; длина лептоспир 5—20 мкм, диаметр 0,1—0,2 мкм, концы загнуты в виде крючков или имеют булавовидные утолщения. Дви­жение лептоспир может быть поступательное, вращательно-поступательное и коле­бательное. Жгутиков у лептоспир нет, подвижность их осуществляется за счет сокращений фибрилл осевой нити тела, идущих во встречном направлении от полюсов клетки. Лептоспиры по Граму окрашиваются отрицательно, по Романовскому — Гимзе (при длительной окраске в 48 часов) — в розово-фиолетовый цвет. Рассмат­ривают эти препараты при обычном конденсоре светового микроскопа (конденсор Аббе). Для люминесцентной микроскопии, готовят препараты-мазки из того же ма­териала, окрашивают флуоресцирующим глобулином для диагностики лептоспироза (глобулины агглютинирующей лептоспирозной сыворотки, меченной ФИТЦ). Просматривают препараты в люминесцентном микроскопе.

Выделение культуры лептоспир, культуральные свойства. Материал высевают на специальные питательные среды – среда Любащенко, Терских (на обычных средах не растут). Из каждой пробы засевают пастеровской пипеткой по 3—5 капель несколько пробирок (5—6) с полужидкой или жидкой средой. Мочу для посева и выделения лептоспир используют только из утренних порций (до кормления животных).