Микробиология и вирусология (стр. 21 )

Задание: Поставить биопробу и произвести вирусоскопию.

Оборудование и материалы: Световые микроскопы, предметные стекла, спиртовая горелка, вирусосодержащий материал, реактивы для окрашивания по методу Морозова, банки с дез. раствором, дистиллированная вода, таблицы.

Рис. 19 Макет вириона оспы.

Содержание занятия. Вирионы оспы относятся к крупным вирусам, кирпичевидной или овоидной формы. Их размеры находятся в пределах 170 – 250 x 300 - 325 нм. Они содержат двухцепочную ДНК, представляющую гантелеобразный нуклеоид, покрытый трехслойной оболочкой. На его противоположных сторонах находятся боковые тела. На наружной оболочке располагаются отростки, придающие поверхности вириона характерный рисунок. Вирусы оспы содержат фермент РНК-полимеразу и обший нуклепротеидный антиген.

Оспа овец и коз — острая контагиозная болезнь, протекающая с признаками папулезно-пустулезных поражений кожи. Вирус, вызывающий оспу у овец, непатогенен для коз и на­оборот.

Оспа птиц. Данную болезнь вызывают несколько самостоятельных вирусов оспы кур, ос­пы голубей, оспы индеек, оспы канареек и оспы скворцов. Оспа у кур проявляется в двух клинических формах: кожной и дифтеритической. В последнем случае преимущественно поражаются слизистые оболочки ротовой полости, носа и коньюктива.

Взятие материала для диагностических исследований. Содержимое везикул. Пораженную поверхность кожи протирают ватным тампоном, смоченным спиртом. Везикулу прокалывают тонко оттянутым капилляром пастеровской пипетки, которую наклоняют для обеспечения сбора жидкости. Папулы и корочки. Их соскабливают скальпелем и собирают пинцетом. Мазки из свежих везикул. Везикулы осторожно срезают лезвием безопасной бритвы и поверхностью среза на предметном стекле делают отпечатки, затем высушивают па воздухе. При диагностике оспы кур направляют голову, имеющую характерные признаки поражения.

Порядок исследования при оспе овец:

1. Вирусоскопия.

2. Обнаружение специфического антигена вирусов оспы методом РИФ и РДП.

3. Биопроба на неиммунной молодой овце. В этом случае вируссодержащую суспензию готовят общепринятым способом, которую в дозе 0.1—0.15 мл вводят внутрикожно в бесшерстную поверхносгь хвоста и ведут наблюдение в течение 10 дней. В положительном случае на месте инъекции развивается характерный оспенный процесс (розеола, папула, везикула, пустула, некроз). Специфичность биопробы подтверждают путем обнаружения элементарных телец Борреля.

Порядок исследования при оспе кур:

1. Вирусоскопия.

2. Выделение вирусов оспы путем заражения КЭ на ХАО и идентификация в РДП.

3. Биопроба на цыплятах. Заражение цыплят производят на скарифицированную кожу гребня, сережек и в перьевые фолликулы голени. В положительном случае на 5—7 день по­являются характерные оспенные поражения. Методом вирусоскопии удается обнаружить элементарные тельца.

Обнаружение вирионов оспы методом световой микроскопии (вирусоскопия).

С помощью светового микроскопа могут быть обнаружены только крупные вирионы, размеры которых превышают 200 нм. Хотя они и лежат в пределах разрешающей способ­ности, но видеть их без специальных методов обработки не удается. Для обнаружения вирионов оспы (элементарных телец) применяют различные методы окраски препаратов, по­зволяющих искусственно увеличить вирусную частицу и повысить контрастность микрокартины. Лучшим из них является окраска препаратов аммиачным серебром по Морозову. Дан­ный метод основан на последовательном использовании трех реактивов.

Реактив № 1 (фиксатор - жидкость Руге): 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл 40%-ного формальдегида, 100 мл дистиллированной воды.

Реактив № 2 (протравитель): 5 г танина, 100 мл дистиллированной воды, 1 мл жидкой карболовой кислоты.

Реактив № 3 (краситель): 5 г азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дистиллиро­ванной воды и 20 мл отливают в другой сосуд, а к оставшимся 80 мл раствора по каплям добавляют 25%-ный раствор аммиака, пока не растворится осадок до легкой опалесценции. Если аммиака окажется много, то в этом случае добавляют по каплям раствор азотнокисло­го серебра до нужной концентрации. Для окраски препаратов оспы используют разведенный раствор 1:10.

Окраска препаратов.

Мазки высушивают на воздухе и обрабатывают реактивом № 1 в течение 1.5- 2 мин., затем промывают водой, наносят реактив № 2 и подогревают на легком пламени спир­товки до отхождения паров — 1 мин. Препарат тщательно промывают водой и наносят реактив № 3, подогревают до появления темно-коричневой окраски (1—2 мин.), снова про­мывают водой и высушивают на воздухе.

В положительном случае на желтом фоне обнаруживают мелкие округло-овальной формы темно-коричневые тельца, лежащие группами, рядами или скоплениями, но не оди­ночно.

Контрольные вопросы:

1 Морфология и структура вирусов оспы.

2 На каком принципе основан вирусоскопический метод?

3 Как проявляется оспа у овец и кур?

4 Как проводят биопробу при оспе овец?

5 Как проводят биопробу при оспе кур?

6 Культивирование и выделение вируса оспы кур.

2.2 Тема: Лабораторная диагностика бешенства

Бешенство — острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с леталь­ным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие жи­вотные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфек­ции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от ме­ста и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1—3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основ­ном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у со­бак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (па­ралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бе­шенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения мо­жет не быть.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Про­никая с периферии (место укуса) по нервным стволам в централь­ную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae, роду Lyssavirus. Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион виру­са — РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5—10 мин, солнечный свет — за 5—7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5—10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наруж­ный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих анти­тел, а нуклеокапсидный — комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

В организме вирус локализуется главным образом в централь­ной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.

Культи­вируется на мышах, кроликах, морских свинках и других живот­ных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предваритель­ной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуци­рует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.

Источником инфекции являются больные животные. Они переда­ют вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основ­ным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, име­ющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным мате­риалом необходимо строго соблюдать меры личной безопаснос­ти: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, ре­зиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защит­ные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством жи­вотных в полевых условиях запрещено.

Получение пат. материала. Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных — голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектици­дами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые меш­ки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.

Лабораторная диагностика. Она включает: обнаружение вирус­ного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуо­ресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ. На обезжиренных предметных стек­лах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов голов­ного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).