Микробиология и вирусология (стр. 11 )

РП ставят в специаль­ных маленьких пробирках Уленгута или методом диффузии в агаровом геле. В пробирки пастеровской пипеткой наслаивают компоненты в равных объемах – вначале стандартная сыворотка, затем антиген. При положительном результате на границе двух жидкостей почти сразу или в течение 1-2 минут образуется резко ограниченное беловатое кольцо или диск – преципитат.

Контроли РП: 1. Преципитирующая сыворотка: а) со стандартным сибиреязвенным антигеном (результат положительный в течение 1—2 минут), б) с экстрактом из заведомо бла­гополучных боенских кож (результат отрицательный в течение 1 часа), в) с экстра­гирующей жидкостью (результат отрицательный в течение 1 часа).

2. Контроль ас­бестовой ваты на нейтральность (при поступлении каждой новой партии асбестовой ваты). Учет результатов РП проводят через 10—15 минут пресно-сухое (одиночных проб); через 30 минут — пресно-сухое (сдвоенных проб), сухосоленое (одиночных); через 60 минут — сухосоленое (сдвоенное), мокросоленое.

Диагноз на сибирскую язву считают установленным при получении поло­жительного результата хотя бы в одном из следующих случаев:

ü  выделении из исследуемого материала культуры бактерий, патогенной для ла­бораторных животных, и со свойствами, характерными для возбудителя си­бирской язвы;

ü  гибели зараженных животных и обнаружении в их организме возбудителя си­бирской язвы при отрицательных высевах из исходного исследуемого мате­риала на питательные среды;

ü  положительном результате иммунофлуоресценции, в сочетании с обнаружением капсульных микроорганизмов, типичных для возбудителя сибирской язвы в патологическом материале;

ü  положительном результате РП;

ü  лизабельность сибиреязвенным фагом;

ü  феномен «жемчужного ожерелья»

Диагностика: учитывают эпизоотические, клинические, патологоанатомические данные, результаты бактериологического и серологического (реакция преципитации) исследований. У свиней используют аллергический метод диагностики.

Контрольные вопросы:

1. Правила взятия патологического материала.

2. Методы бактериологической диагностики сибирской язвы.

3. Морфологические, тинкториальные и культуральные свойства В. anthracis.

4. anthracis от сапрофитных спорообразующих аэробов.

5. Идентификация при помощи сибиреязвенного бактериофага.

6. Феномен «ожерелья».

7. Серологические методы обнаружения сибиреязвенного антигена в исследуемом материале.

1.9 Тема: Патогенные анаэробы - возбудители злокачественного оттека, эмфизематозного карбункула.

Цель занятия: Усвоить правила отбора и пересылки патологического материала для бактериологического исследования, отличительные особенности морфологи­ческих, культурально-биохимических свойств названных патогенные микробов и особенности их культивирования.

Задание:

1. Вскрыть труп морской свинки.

2. Сделать высев на среду Китта-Тароцци.

3. Сделать мазки-отпечатки.

4. Окрасить мазки простым методом.

5. Микрокартину зарисовать в тетради.

Материалы и оборудование: Трупы морских свинок павших после заражения культурой - С. chauvoei; питательные среды — МППБ Китта — Тароцци, глюкозно-кровяной агар (в чашках Петри), среда Вильсона — Блера, стерильные пасте­ровские пипетки, стерилизованные наборы инструментов в стерилизаторах для вскрытия трупов морских свинок (для каждой свинки отдельный комплект инст­рументов), склянки с дезраствором (3—5 %-ный фенол или лизол), вата гигро­скопическая; посевы с предыдущего занятия; микроанаэростаты (или эксикато­ры). Для демонстрации необходимы таблицы (морфология микробов-анаэробов, формы колоний), биопрепараты. Таблицы бактериологического исследования.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 13, спорообразующие Г “+” палочки

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Bacillaceae;

Род – Clostridium;

Виды – Cl. perfringens, Cl. Septicum, Cl. oedematiens – возбудитель злокачественного отека, дизентерии ягнят, брадзота овец; Cl. chauvoei – Эмкар; Cl. tetani – столбняк; Cl. botulinum – возбудитель ботулизма.

Возбудители злокачественного отека — С. perfringens, С. septicum, С. novyi (oedematiens), С. histolyticum, а также С. sordellii, С. gigas и др. (каждый из них мо­жет быть в сочетании с другими анаэробами и аэробами). Злокачественный отек (газовая гангрена, раневой газовый отек) — острая неконтагиозная раневая инфекция, заболевание полимикробной этиологии, развивающееся вследст­вие проникновения микробов с раневой поверхности в глубь раны. Заболевание характеризуется быстро распространяющимся болезненным отеком мягких тканей, их разрушением, образованием в пораженных тканях газах и интоксикацией организма. Поражает животных и человека. У крс злокачественный отек может наблюдаться после отелов, сопровождающихся повреждениями и ранениями родовых путей, а также после абортов.

Патологический материал. Воспалительный экссудат и кусочки пораженной ткани из очага воспаления. Если материал нельзя быстро доставить в лабораторию, его консервируют в 40 %-ном водном растворе глицерина или же полоски нарезанной пораженной ткани в марлевом мешочке (защита от мух) высушивают на возду­хе. Перед исследованием материал растирают в стерильной ступке с добавлением физраствора (если материал консервирован глицерином, его предварительно про­мывают стерильным физраствором, затем растирают). Пипеткой Пастера высевают полученную взвесь в среду Китта-Тароцци, Вильсона-Блера, помещают в тер­мостат при +38 °С. Естественно, что первичный рост культуры будет смешанный, поэтому выросшие культуры пересевают на кровяной МПА (пластинчатый посев по методу Дригальского), что позволит при последующем пересеве отдельных коло­ний, характерных для того или иного вида возбудителей злокачественного отека, получить чистую культуру, с которой проводят дальнейшее исследование для ее идентификации в соответствии с характеристикой каждого из них.

Морфология Clostridium perfringens — это крупная полиморфная палочка с закругленными концами, длиной 4-8 мкм. Неподвижная, окрашивается грамположительно. В почве, воде, навозе образует спору; на средах бедных углеводами и богатых белками, споры образуются при длительном культивировании. Поэто­му иногда для активизации спорообразования к питательным средам добавляют мел. Споры крупные овальные, расположение центральное или субтерминальное. Перфрингенс — один из всей данной группы анаэробов образует капсулу в инфицированном организме. Капсула окружает микроб в виде светлого ободка, который хорошо виден

Рис.14 Clostridium perfringens в мазке

Культуральные свойства. Анаэроб. В жидкой среде Китта-Тароцци рост С. perfringens проявляется равномерным помутнением среды с обильным газообразованием. Через 2—3 дня микробная масса оседает на дно пробирки, бульон просветляется. Культура имеет запах маслянистой кислоты. На кровяном агаре растет в виде круглых, выпуклых, сочных, с ровными краями в начале сероватого, затем зеленого цвета ко­лоний, с обширной зоной гемолиза. На среде Вильсона — Блера образует черные колонии, мозговую среду не изменяет. Помимо обычно описываемых классических форм колоний и морфологии бактериальных клеток, следует учитывать вариабельность С. perfringens. Встречаются S-формы колоний, содержащие короткие палочки; при введении их в организм животного они не образуют капсулу. Иногда отмеча­ется рост слизистых М-форм колоний, бактерии из которых капсулообразующие, а также шероховатые R-формы колоний с неровными краями. В препаратах маз­ках из таких колоний видны нитевидные формы, цепочки. Колонии на глюкозно-кровяном агаре зеленого цвета, окружены зеленой зоной а-гемолиза (альфа-токсин, лецитиназа). Попадаются и смешанные колонии.

Ферментативные свойства. Чистую культуру микроба засевают в молоко, желатину (столбиком), среды с углеводами. Посевы помещают в микроанаэростат и выдерживают 16-18ч в термостате. Интенсивно проявляются сахаролитические свойства — перфрингенс ферментирует с образованием кислоты и газа лактозу, сахарозу, мальтозу, крахмал и не ферментирует дульцит и маннит. Типичным для этого микроба является характер свертывания молока — образуется губчатый сгусток казеина, и обилие газа под­нимает его вверх. Желатину и свернутую сыворотку разжижает медленно.

Биопроба. Внутримышечное (или подкожное) заражение вызывает гибель животных через 16—24 часа. Для биопробы используют морских свинок, голу­бей, кроликов, белых мышей.

Антигенное строение. С. perfringens продуцирует сложный экзотоксин, обладающий летальным, некротизирующим и гемотоксическим действием. По антигенной структуре разделяяют на 6 типов сероваров, обозначаемых заглавными буквами латинского алфавита — А, В, С, D, Е, F. Каж­дый из названных токсинов нейтрализуется гомологичной (типоспецифической) антитоксической сывороткой.

Серова типа А вызывает газовую гангрену у животных и человека, пищевые токсикоинфекции у людей, является возбудителем энтеротоксемии телят и свиней.

С. perfringens, продуцирующие токсин типа В является возбудителем анаэробной дизентерии у ягнят, козлят, телят, поросят и жеребят, цыплят.

Серовар типа С обусловливает некроти­ческий энтерит у поросят (со смертельным исходом), брадзот овец.

D-токсин вызывает энтеротоксемию овец («мягкая почка»), а также и кишечные заболевания у че­ловека.

Токсины А, С, D и Е могут быть причиной энтеротоксемии телят, гастро­энтерита у взрослого крупного рогатого скота, токсин С и F-токсин вызывает язвенный энтерит у овец и может быть при­чиной некротического энтерита у людей.

С. perfringens следует учитывать с общесанитарных позиций при проведе­нии бактериологических исследований кормов (санитарная оценка). Этот микроб может быть причиной пищевой интоксикации (токсикоинфекции) у человека.

Морфология С. septicum. Микроб палочковидной формы, длиной 2—8 мкм, шириной 0,8—1 мкм, подвижный (перитрих), капсулу не образует. Образует спо­ру как в почве, воде, так и на питательных средах и в инфицированном ор­ганизме. Спора обычно лежит центрально. Грамположительный. В мазках из культуры клетки располагаются одиночно или короткими цепочками, а в мазках с серозной поверхности печени, из экссудата — длинными нитями.