Микробиология и вирусология (стр. 5 )

Бактериологический диагноз на рожу свиней считают установленным в следующих случаях: 1) при обнаружении возбудителя рожи свиней МФА в ис­следуемом материале или в смешанной культуре без выделения чистой культуры; 2) при выделении из патологического материала культуры с характерными для возбудителя свойствами на питательных средах; 3) в случае гибели лабораторных животных и выделения из органов культуры возбудителя рожи, даже если в посе­вах из исходного материала возбудитель не выделен.

Общий диагноз ставится на основании:

- эпизоотологических данных (заболевание молодых свиней и поросят отъемного возраста, возникающее обычно в жаркое время года),

- клинических признаков (красные пятна на коже, имеющие форму различных геометрических фигур, высокая температура),

- данных вскрытия (катаральное и катарально-геморрагическое воспаление желудка и тонкого отдела кишечника, серозный перикардит, бородавчатый эндокардит, неравномерная окраска миокарда, венозный застой и кровоизлияния в почках)

Ø  Лабораторных исследований:

-  Бактериологическая диагностика

-  Дифференциальная диагностика

-  Серологическая диагностика

-  Биопроба.

Срок лабораторного исследования, с целью постановки диагноза на рожу свиней, составляет 7 дней.

Схема лабораторной диагностики рожи свиней

Контрольные вопросы:

1. Латинское наименование возбудителя рожи свиней.

2. Морфологические, культуральные и биохимические свойства возбудителя.

3. Правила взятия и пересылки патологического материала для исследования на рожу

свиней.

4. Критерии дифференциации возбудителей рожи свиней и листериоза.

5. Виды лабораторных животных, пригодных для постановки биопробы при ис­следовании

на рожу свиней.

6. Методы серологической идентификации возбудителя рожи свиней.

1.4 Тема: Возбудитель листериоза

Цель занятия: Ознакомить студентов с правилами взятия, упаковки и пересылки патологического материала. Усвоить методы бактериологических и серологиче­ских исследований для диагностики листериоза.

Задание:

1. Произвести вскрытие трупов белых мышей и сделать посевы на МПА, МПБ из крови

сердца, печени или селезёнки

2. Сделать препараты-отпечатки из органов и препараты из бульонной культуры для

определения их подвижности, окраска мазков для микроскопирования.

3. Изучить культуральные и биохимические свойства возбудителя.

4. Поставить РА на стекле с поливалентной листериозной сывороткой.

Материалы и оборудование. Трупы белых мышей, павших после заражения вак­цинным штаммом листерий; наборы стерильных инструментов для вскрытия, пастеровские пипетки; 12-часовая бульонная культура вакцинного штамма лис­терий, выращенная при комнатной температуре; поливалентная листериозная сыворотка, флуоресцирующая листериозная сыворотка, чашки Петри с филь­тровальной бумагой.

Для демонстрации: суточная культура листерий, выращен­ная в средах с углеводами — глюкозой, мальтозой, рамнозой, салицином, трегалозой, дульцитом, раффинозой; биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 14, неспорообразуюшие грамположительные палочки.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Corynebacteriaceae;

Род – Listeria;

Виды – Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. seeligeri, L. grayi, L. murrayi.

Возбудитель листериоза сельскохозяйственных животных - Listeria monocytogenes.

Листериоз – инфекционная болезнь животных многих видов и человека. Характеризуется поражением центральной нервной системы (менингоэнцефалиты), половых органов (аборты), молочной железы (маститы) и явлениями септицемии. Болеют многие виды сельскохозяйственных и диких животных, грызунов, птиц.

Патологический материал. В лабораторию следует направлять трупы мел­ких животных (грызунов), голову павшего животного (для исследования мозга), паренхиматозные органы (печень, селезенка, почка и пораженные участки лег­ких), абортированный плод, плодные оболочки, истечения из родовых путей, мо­локо из пораженной доли вымени. От больных подозреваемых в заражении жи­вотных также берут кровь для серологических исследований.

Рис.8 Жгутики у листерии. Рис.9 Окраска по Граму (эл. микроскопия).

Микроскопия. Мазки-отпечатки из органов, включая головной мозг, окрашивают по Граму и методом флуоресцирующих антител. В препаратах, окрашенных по Граму, листерии имеют вид грамположительных палочек, могут встречаться поли­морфные клетки размером 0,5x2 мкм. Спор и капсул не образуют. Подвижны (6-12ч. культуры).

Обнаружение при люминесцентной микроскопии в патологическом материале морфологически типичных для листерий бактерий, светящихся на 3—4 креста, позволяет поставить положительный люминесцентно-серологический диагноз.

Рис.10 Флюоресценция листерий в люминесцентном микроскопе.

При сомнительном или отрицательном ре­зультатах люминесцентной микроскопии проводят исследование материала с це­лью выделения культуры возбудителя.

Культивирование и культуральные свойства. L. monocytogenes — аэроб (факультативный анаэроб). Температурный оптимум +37 °С. Наиболее интенсивно бактерии развиваются при температуре 25-37ºС, но способны размножаться и при низких температурах: от 2°С до 4°С в почве, воде, на растениях, в органах трупов. В различных пищевых продуктах (молоко, мясо и др.) размножаются при температуре бытового холодильника. При этих условиях культивирования листерий дают хороший рост, хотя и замедленный в сравнении с выращиванием при 37°С. Верхняя температурная граница роста – 42-44°С.

При температуре 70°С погибают через 20-30 минут, при 100°С - через 3-5 минут; инактивируются растворами формалина (0,5%-1%), фенола (5%), хлорной извести (100 мг активного хлора в 1 л).

Listeria monocytogenes растет на многих питательных средах, основу которых составляет мясо-пептонный бульон, бульон Хоттингера, мясо-пептонный агар, картофельный агар, мозговой агар с добавлением глюкозы (0,5-1%), глицерина (2-3%), дрожжевого экстракта (10%), сыворотки крови (10%), сердечно-мозговой бульон, МПА с теллуритом калия и сывороткой крови, а также на некоторых синтетических средах. В настоящее время широко применяют новые среды для селективного обогащения и выделения листерий – Fraser бульон, Half - Fraser бульон, Oxford -, Palcam - агар и др.

Из патологического материала делают обильные посевы на перечисленные среды. При исследовании абортированных плодов посевы производят из содержимого желудка и внутренних органов. Истече­ния из половых органов и молоко засевают на печеночный агар с добавлением 1 % глюкозы и 2—3 % глицерина из МПБ с 10 % NaCl.

Рис.11 Рост листерий на Palcam – агаре

В последнем случае после по­явления роста из МПБ делают высев на плотные питательные среды. Наблюдение за посевами продолжают в течение 2 недель. Параллельно часть исследуемого мате­риала рекомендуется выдерживать в холодильнике (+ 4°С) до 30 дней, поскольку при этой температуре происходят размножение и накопление листерий. При отри­цательном результате первичного посева из сохраняемого материала каждые 10 дней производят повторные высевы на питательные среды. Данный методический прием позволяет увеличить количество положительных бактериологических нахо­док, но исследование занимает длительный срок. Возбудитель листериоза в МПБ вызывает легкое помутнение бульона и формирует мелкие росинчатые колонии на МПА. На кровяном агаре растет, образуя зону α-гемолиза. Просмотр посевов на твердых средах лучше проводить в проходящем свете с осветителем ОИ-19 с голубым светофильтром. При этом ко­лонии листерий, в отличие от колоний других микроорганизмов, имеют голубую окраску с зеленоватым оттенком и мелкозернистую структуру. На средах типа PALCAM-агара через 24ч. инкубирования листерии формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5-1,0 мм, иногда с черным центром. Через 48ч. колонии диаметром 1,0-2,0 мм приобретают зеленую окраску с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая микрофлора (бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus) образуют желтые колонии за счет ферментации маннита.

Из культур готовят мазки, окрашивают по Граму или флуоресцирующими сыворотками в прямом и непрямом вариантах. В мазках, окрашенных по Граму, и положительных случаях обнаруживают небольшие грамположительные палочко­видные бактерии (0,5x1—2 мкм) с закругленными концами, располагающиеся одиночно, в виде римской пятерки, коротких цепочек или параллельно. Возбуди­тель спор и капсул не образует, подвижен. Подвижностью обладают листерий в молодой (6-12-ч.) бульонной культуре, выращенной при пониженной температуре (+20-22 °С).

Ферментативные свойства изучают у культур, имеющих типичную для листерий морфологию. Листерии относятся к группе сравнительно малоактивных в ферментативном отношении бактерий. Не образуют индол, аммиак, сероводород, не гидролизуют мочевину. Способны разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, салицин, рамнозу, мальтозу, при отсутствии разложения дульцита, инозита, инулина и арабинозы. Каталазную активность определяют добавлением свежеприго­товленной 5 %-ной перекиси водорода к суточной бульонной культуре в равном объеме или нескольких капель в агаровую культуру. Образование пузырьков газа («пены») свидетельствует о наличии у культуры фермента каталазы, что харак­терно для листерий. Все виды Listeria обладают гемолитической и лецитиназной активностью. Для культур L. monocytogenes характерна вокруг места укола узкая зона гемолиза. Для окончательной идентификации патогенных листерий рекомендуется использовать КАМП-тест (метод Christie – Atkins – Munch – Peterson), ферментацию углеводов и определение активности на средах с углем и без него.