Микробиология и вирусология (стр. 6 )

С целью дифференциации возбудителя листериоза от возбудителя рожи свиней используют также индикаторные среды с красителями. Метод основан на редукции и оксидации красок в средах под влиянием листерий, растущих на дан­ных средах. Листерий обесцвечивают среду с лакмусом, нейтральротом в смеси с метиленовой синькой через 3—6 часов. Возбудитель рожи свиней не обес­цвечивает сред с красителями.

Серологическую идентификацию проводят в пластинчатой РА на стекле. Для этой цели первоначально используют поливалентную листериозную сыво­ротку, агглютинирующую все сероварианты листерий. После идентификации на уровне вида ставят РА с серогрупповыми сыворотками, позволяющими отнести выделенную культуру листерий к определенному серотипу (серогруппе). В каче­стве антигена для пластинчатой РА с поливалентной сывороткой используют 24—30-часовую агаровую культуру, выращенную при +18—26 °С. При опреде­лении серотипа применяют в качестве антигена +18—24-часовую агаровую куль­туру, выращенную при +37 °С. Пластинчатую РА ставят по общепринятой мето­дике, учет результатов осуществляют в течение 3 минут. Появление хлопьев в капле смеси антиген — сыворотка и отсутствие их в контроле (физраствор с ан­тигеном) оценивают как положительный результат РА.

Биопроба. Суспензией из органов и тканей заражают подкожно или внутрибрюшинно в дозе 0,3—0,5 мл белых мышей массой 18 г или особо чувстви­тельных 5—6-дневных мышат. Мышата погибают в положительных случаях че­рез 18— 36 часов. За животными массой 16—18 г наблюдают в течение 14 суток. Из внутренних органов павших животных делают посевы на питательные среды и мазки-отпечатки.

Для дифференциации возбудителя листериоза от возбудителя рожи свиней прибегают к специальным тестам определения патогенности исследуемой культуры в виде конъюнктивальной и кожной пробы. Конъюнктивальную пробу ставят путем нанесения исследуемой суточной культуры на конъюнктиву глаза морской свинки. Листерии через 2—4 дня вызывают развитие гнойного конъюнктивита (и кератоконъюнктивита). Кожную пробу ставят введением 0,3— 0,5 мл суточной бульонной культуры внутрикожнно в область бока кролику или морской свинке. Листерии через 1—2 суток вызывают некроз кожи.

Серологическая диагностика. Используют РА и РСК. Результат РА призна­ется положительным, если реакция оценивается не менее чем на два креста в раз­ведении сыворотки: для овец, коз и свиней — 1:200, для лошадей и крупного ро­гатого скота — 1:400, для кроликов — 1 : 50. Сомнительный результат — РА не менее чем два креста в разведении сыворотки овец, коз, свиней — 1:100, лошадей и крупного рогатого скота — 1 : 200, В РСК сыворотки исследуют в разведении 1:10. Положительный результат — при оценке реакции в четыре креста и три креста (+++), сомнительный — при оценке ++ и +. От животных, давших сомни­тельный результат РСК, полагается повторно исследовать пробы крови через 2—3 недели. Серологическая диагностика является вспомогательной. Основное зна­чение имеют данные бактериологического исследования.

Положительный бактериологический диагноз на листериоз ставят при ус­ловии выделения грамположительной полиморфной, подвижной палочковидной бактерии, обладающей каталазной активностью, расщепляющей с образованием кислоты без газа глюкозу, рамнозу, мальтозу, салицин, дающей положительную конъюнктивальную или внутрикожную пробу и реагирующей в РА с листериозными сыворотками. Как вспомогательный метод используют идентификацию листерий с помощью листериозного бактериофага L 2А и L4A.

Профилактика листериоза включает борьбу с заболеванием среди домашних животных, дератизацию. Употребление непастеризованного молока и загрязнённой воды должно быть исключено.

Схема бактериологического исследования при листериозе животных

Таким образом, продолжительность выявления патогенных листерий при использовании классических методов согласно государственному стандарту составляет 5-7 сут. Вместе с этим проведение исследований традиционными методами микробиологического анализа связано трудоемкостью, длительностью и недостаточной специфичностью. Становится очевидной необходимость совершенствования микробиологических методов диагностики с целью обеспечения безопасности пищевых продуктов, в частности определения L. monocytogenes. К таким методам, обеспечивающим выявление патогенных листерий в кратчайшие сроки, относятся молекулярно-генетические методы: ДНК-РНК гибридизация, полимеразноцепная реакция (ПЦР), иммуноферментный метод (ИФА).

Контрольные вопросы:

1. Виды животных, восприимчивых к листериозу.

2. Пат. материал и его бактериологическое исследование для диагно­стики листериоза.

3. Питательные среды, применяемые для культивирования листерий, культу­ральные и ферментативные особенности.

4. Морфология и тинкториальные свойства листерий.

5. Критерии, дифференци­рующие листерий от бактерий рожи свиней.

6. Методы серологической идентификации листерий.

7. Современные методы диагностики листериоза.

1.5 Тема: Возбудители эшерихиозов. Колибактериоз.

Цель занятия. Усвоить правила отбора и пересылки патологического материала в лабораторию, а также освоить методику проведения бактериологического иссле­дования патматериала.

Задание:

1. Сделать посев взвеси бактерий из пробирок на МПБ по 2 пробирки, МПА, МПЖ, среда

Левина, агар Эндо.

2. На засеянных пробирках и чашках Петри поставить № исходной куль­туры и поставить

в термостат.

3. Приготовить мазки из исходной культуры, окрасить по Граму, микроскопировать и

зарисовать.

Материалы и оборудование. Пробирки со взвесью микробных культур, обозна­ченных цифрой (шифр),— бактерий Е. coli и Salmonella; питательные среды — МПБ, МПА, МПЖ в пробирках, среды с лактозой, глюкозой и индикатором, агар Эндо и агар Левина в чашках Петри, кровяной агар, пастеровские пипетки, реактивные бумажки для определения индола, среда с сернокислым железом для определения сероводорода.

Для демонстрации: таблица-схема хода исследования пат. материала на колибактериоз, а также биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Gracilicutes;

Секция – 5, грамотрицательные факультативные анаэробы.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Enterobacteriaceae;

Род – Escherichia;

Вид – Escherichia coli (животные и человек), E. blatta (насекомые).

Возбудитель эшерихиозов (колибактериоза, отечной болезни свиней) - Е. coli (кишечная палочка). Колибактериоз - это остропротекающее инфекционное заразное заболевание молодняка разных видов животных (включая птиц и пуш­ных зверей). Характеризуется, как правило, диареей (профузным поносом), обез­воживанием организма, депрессией, нарастающей слабостью и смертельным ис­ходом. Колибактериоз протекает в трех формах: септической, энтеротоксемической и энтеритной. При последних двух формах сепсис отсутствует. Телята вос­приимчивы в первые часы и дни после рождения; поросята заболевают как в пе­риод новорожденности, так и после отъема. Кроме того, у поросят встречается еще одна форма эшерихиоза — отечная болезнь. Ягнята заболевают с первых дней после рождения до 5—6-месячного возраста. Птица поражается в основном в первые 2 - 4 месяца Взрослые животные колибактериозом не болеют, но явля­ются бактерионосителями патогенных штаммов Е. coli. Кишечная палочка может быть также возбудителем эндометрита и мастита у коров.

Патологический материал. Для бактериологического исследования прижизненно в лабораторию направляют фекалии от больных животных. Для посмертной диагностики: свежий труп или трубчатая кость, доля печени с желчным пузырем, селезенка, почка, сердце у аорты, перевязанное лигатурой, брыжеечные лимфоузлы, отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанного с двух сторон (упаковка отдельно от остального материала).

В лаборатории при вскрытии трупа теленка (поросенка, ягненка), помимо указанного материала, исследуют еще и головной мозг. Трупы (целиком) направ­ляют в лабораторию в водонепроницаемой таре. Если не представляется возмож­ным доставить материал в кратчайший срок (4 часа), его консервируют (кусочки органов) стерильным 30 %-ным водным раствором глицерина или 10 %-ным рас­твором NaCl. В лаборатории материал исследуют соблюдая правила асептики: проводят посевы на питательные среды — МПБ, МПА, среды Эндо или Левина. В пробирки со средами посевы проводят пастеровскими пипетками (2—3 капли), а на плотные питательные среды в чашках Петри материал наносят шпателем. Кроме того, посевы из печени, почки, лимфоузлов, селезенки и головного мозга осуществляют методом отпечатков на поверхности агара в чашках (Эндо и др.). Для этого, придерживая стерильным пинцетом, стерильными ножницами выре­зают кусочек ткани, фламбируют его и разрезанной поверхностью касаются по­верхности среды. Посевы помещают в термостат. После посевов из исследуемого материала готовят мазки-отпечатки из пе­чени, селезенки, крови из сердца, фиксируют и окрашивают по Граму.

Микроскопия. Определяют морфологические и тинкториальные свойства. На препаратах «висячая капля» устанавливают подвижность (или ее отсутствие) у бактерий. coli — подвижный микроб (перитрих), но встречаются и не­подвижные варианты. Форма его палочковидная с закругленными концами, ок­рашивается грамотрицательно (розово-красный цвет),- споры не образует; длина микробной клетки 1—3 мкм, ширина — 0,8 мкм. Располагаются бактерии оди­ночно. Капсулу не образует, за исключением отдельных штаммов серогрупп 08, 09,0101.

Рис.12 Кишечная палочка. Окраска по Граму.

После инкубирования засеянных пробирок и чашек Петри в термостате вы­росшие культуры бактерий вновь просматривают под микроскопом. Типичные колонии на средах Эндо (или Левина) пересевают для получения чистой культу­ры в пробирках с МПБ и МПА. Полученную чистую культуру пересевают на специальные дифференциально-диагностические среды для определения биохимических и антигенных свойств возбудителя колибактериоза (посредством РА), а также его патогенности (биопробой).