Микробиология и вирусология (стр. 13 )

Задание:

1. Готовые фиксированные мазки окрасить по Граму;

2. Просмотреть под микроскопом, микрокартину зарисовать в тетради.

Материалы и оборудование: Белые мыши с клиническими признаками ботулизма и столбняка (животные подготовлены заранее); готовые фиксированные препараты-мазки микробных культур С. tetani, С. botulinum. Мазки (фиксированные) из некротизированной ткани кролика, зараженного Fusobacterium necrophorum; биопрепараты.

Возбудитель столбняка — Clostridium tetani широко распространен в при­роде — почве, воде, навозе, фекалиях; вызывает остропротекающую неконтагиозную раневую токсикоинфекцию у животных (и человека), при которой нервная система поражается экзотоксином микроба. Болезнь возникает в результате различных травм и ранений при условии внесения в них спор возбудителя, и сопровождается тоническими и клоническими сокращениям мышц.

Патологический материал направляют в лабораторию в сомнительных случаях. Для этого исследуют раневой воспалительный экссудат: пастеровской пипеткой высевают его в среду Китта-Тароцци (можно использовать также бульон и агар Мартена, казеиновые, рыбно-казеиновые среды). Посевы инкуби­руют в термостате 5—7 дней (срок накопления токсина). Полученную смешан­ную культуру фильтруют через асбестовые фильтровальные пластинки, фильтрат подкожно вводят белым мышам или морским свинкам. При наличии столбнячно­го токсина животные гибнут с выраженной клинической картиной столбняка. Па­раллельно (если необходимо) материал (экссудат) исследуют под микроскопом, а затем делают высевы на глюкозно-кровяной агар.

При исследовании выделяют возбудителя столбняка и его токсин.

Морфологические, культурально-биохимические особенности. С. tetani — крупная тонкая подвижная грамположительная палочка, длиной 4—8 мкм; образует спо­ру, как правило, терминально, диаметр споры превышает диаметр вегетативной клетки, придавая форму барабанной палочки. Столбнячные споры очень стойкие, выдерживают длительное кипячение. Палочки со спорами не подвижны. Капсуле не синтезируют.

С. tetani — строгий анаэроб, оптимальная температура роста +37 °С, рН среды 7,4—7,9. Рост проявляется равномерным помутнением жидкой среды Китта-Тароцци с последующим ее просветлением за счет осаждения микробной массы на дно пробирки (3—4 дня) в виде рыхлого осадка. Висмут сульфит-агар (и мозговая среда) при росте С. tetani чернеет. На глюкозно-кровяном агаре растет в виде не­больших колоний с неровными краями, нежные беловато-серые колонии в виде капелек росы. Зона гемолиза проявляется не у всех штаммов.

В процессе роста на питательных средах происходит ферментация белков (протеолиз) с образованием газообразных продуктов с неприятным запа­хом. Медленно разжижает желатину. Углеводы почти не ферментирует, молоко не свертывает. Образует сероводород, аммиак, индол. Встречаются штаммы, слабо ферментирующие глюкозу, мальтозу, сахарозу.

Токсин в организме животного распространяется по осевым цилиндрам нерва или по экто - и эндоневральным лим­фатическим путям. Иммунитет при столбняке — антитоксический.

Ботулизм

Возбудитель ботулизма — Clostridium botulinum. Ботулизм — кормовое (пищевое) отравление, кормовая токсикоинфекция, вызывающая заболевание нервно-паралитического характера, проявляющаяся параличом глотки, гортани и конечностей. Смертность 85—100 %.

Патологическим материалом служат остатки корма, вызвавшего отравление (у крупных животных), рвотные мас­сы (у собак, кошек). У павших животных исследуют содержимое желудка, кишечни­ка, лимфоузлы, селезенку, головной мозг. Чтобы избежать, инактивации токсина, каждый вид материала помещают в отдельную банку из темного стекла (или оберты­вают банку черной бумагой), закрывают герметично. Поступивший в лабораторию материал хотя и проверяют на данную культуру, но главным образом исследуют на обнаружение токсина возбудителя. Для выделения культуры взвесь пробы материала высевают на жидкие и плотные питательные среды.

Морфологические и культурально - биологические особенности

Сl. botulinum — крупная (4—6 мкм) подвижная грамположительная палочка. Образует стой­кую спору (выдерживает кипячение 5-6 часов), располагающуюся терминально (реже субтерминально). К наружному концу она расширяется, придавая микроб­ной клетке некоторое

Рис.15. Сl. botulinum в мазке. сходство с теннисной ракеткой. Капсулы не образует. Подвижен, в старых культурах без жгутиков.

Данный микроб — стро­гий анаэроб. Применяют специальные среды: глюкозо-кровянной агар Цейсслера, печеночный агар с глюкозой, среду Китта-Тароцци, бульон Хоттингера. В жидкой среде рост проявляется равномерным помутнением бульона последующим его просветлением (осаждением микробной массы на дно пробирки). На кровяном агаре рост колоний — с отростками и зоной гемолиза. На агаре Цейсслера вырастают прозрачные колонии – росинки блестящие с зоной гемолиза.

Обладает протеолитическими свойствами (гнилостный микроб) — разжижает желатину, пептонизирует молоко с образованием газа, продуцирует сероводород, аммиак, масляную кислоту. Ферментирует с образованием газа и кислоты глюкозу, мальтозу, глицерин, салицин, инозит и не разлагает галактозу, сахарозу, дульцит, манит, рамнозу. Однако эти свойства непостоянны и не служат критерием идентификации и дифференциации микроба. Проду­цирует сильнодействующий экзотоксин, неоднородный по антигенной структуре.

По антигенной структуре различают несколько типов токсинов — А, В, С, D, Е, F. Каждый из них нейтрализует­ся типоспецифической антитоксической сывороткой (антиботулинус). Токсин (глобулин), попадая в кишечник, всасывается в кровь в неизмененном виде, достигает головного мозга, поражает клетки продолговатого мозга, сердечнососудистой системы и мышц. Хотя любой тип токсина опасен для всех видов животных (и человека), но наи­более чувствительными к токсину ботулизма лошади, обусловленный типом В, реже С; у крупного рогатого скота—D и С; у овец и птиц — С; у человека — А, В, Е. Токсин серовара F в нашей стране не обнаружен.

Лабораторные животные (белые мыши, кролики и морские свинки) восприимчивы к ботулинистическим токсинам всех сероваров.

Основной диагностикой при ботулизме является биологическое исследование направленное на обнаружение ботулинистического токсина. Для экстрагирования токсина каждую пробу материала заливают физраство­ром 1:2. Через 1—2 часа полученный экстракт фильтруют через фильтр Зейтца и делят на три порции: одну вводят лабораторным животным подкожно — при нали­чии токсина животные гибнут; вторую прогревают при +80°С 30 минут и инъеци­руют морским свинкам — токсин термолабильный, при прогревании разрушается, морские свинки должны остаться живыми; третью используют для установления специфичности токсина: ее смешивают с поливалентной антитоксической сыворот­кой антиботулинус, выдерживают в термостате 1—2 часа, затем смесь вводят под­кожно морским свинкам — если в фильтрате содержится токсин, он нейтрализуется специфической сывороткой (антитоксинами), животные остаются живыми. Типизацию токсина проводят в реакции нейтрализации (РН) с гомологичными антитоксическими сыворотками согласно прилагаемым инструкциям.

Такой результат дает основание для заключительного диагноза — ботулизм.

Фузариобактериоз (некробактериоз - Necrobacteriosis)

Это инфекционная болезнь многих видов сельскохозяйственных животных и диких млекопитающих, характеризующаяся гнойно-некротическими поражениями кожи, слизистой оболочки, внутренних органов и конечностей.

Возбудитель фузариобактериоза (некробактериоза) — Fusobacterium necrophorum. Палочка некроза обычно вызывает местный некротический процесс, чаще поражаются ткани конечностей, но может развиться и генерализованный про­цесс с образованием метастазов — некротических очагов в печени, легких, почках и др. У северных оленей это заболевание приводит к летальному исходу.

Патологическим материалом для бактериологического исследования слу­жит пораженная ткань — ее берут на границе некротизированной и здоровой. Чистую культуру из такого загрязненного материала получить трудно, поэтому поступают так: некротизированную ткань растирают в ступке с небольшим ко­личеством физраствора, полученной взвесью заражают кролика. После его гибе­ли труп вскрывают и из очагов поражения внутренних органов проводят посевы на питательные среды, готовят мазки-отпечатки из пораженного очага.

Микроскопия. Fusobacterium necrophorum — тонкая неподвижная грамотрицательная палочка, спору и капсулу не образует. В мазках-отпечатках из пораженного очага располагается нитевидными цепочками, окрашивается неравномерно, отмечается зернистость цитоплазмы. Хорошо окрашивается синькой Лёффлера, фуксином Циля.

Культурально-биохимические и патогенные свойства. Облигатный анаэроб. Выделение чистой культуры затруднено, в связи с частой ассоциацией его с другими микробами, особенно стафилококками и стрептококками. Легче получить чистую культуру из внутренних органов – печени, селезенки, легких. Среды для культивирования – Китта-Тароцци, бульон Мартена, Хоттингера, сывороточный и глюкозо-кровяной агары, полужидкий агар, мозговая среда. Оптимальный рН среды 7,4—7,6. В среде Китта-Тароцци через 24-48ч появляется помутнение и на кусочках печени образуется хлопьевидный осадок, с последующим просветлением среды. В сыворо­точном агаре столбиком через 3—4 дня вырастают чечевицеобразные колонии с нитевидными ответвлениями. На глюкозно-кровяном агаре растет в виде мелких росинчатых колоний. Поверхность колоний матовая. Хорошо растет на мозговой среде – почернение среды за счет выделения сероводорода. Сбраживает глюкозу, сахарозу, лактозу, салицин. Не разжижает желатину и свернутую сыворотку, не образует сероводород и индол.