Микробиология и вирусология (стр. 9 )

Классификация:

Отдел – Gracilicutes;

Секция – 4, грамотрицательные аэробные палочки и кокки.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Brucellaceae;

Род – Brucella;

Виды – Br. melitensis (выделен от коз и овец), Br. abortus (выделен от крупного рогатого

скота), is (свиной), Br. ovis (бараний вид), Br. canis (собачий) и Br. neotoma

(кустарниковых крыс).

Бруцеллы — микроорганизмы, вызывающие инфекционную, хронически протекающую болезнь животных (и человека) — бруцеллез. Наибольшее значение в патологии бруцеллеза животных и человека имеют бруцеллы первых трех видов. Бруцеллез жи­вотных преимущественно протекает бессимптомно. Диагностика этой болезни основывается на показаниях результатов серологических, бактериологических, а также аллергических методов исследования с учетом клинических признаков болезни — аборты, бурситы, орхиты, эпидидимиты, эндометриты.

Патологический материал. Для бактериологического исследования на бруцеллез (при жизни животного) в лабораторию направляют: абортированный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей, желудок плода, перевязанный с двух концов лигатурой, кусочки печени и селезенки плода. Молоко берут от коров в стерильные пробирки по 10—15 мл из каждой доли вымени (последние порции), у овец и коз — путем пункции цистер­ны вымени посредством стерильного шприца с иглой. Для исследования молоко отсылают свежим (в день взятия пробы); если это не представляется возможным, то его консервируют (лучше сухой борной кислотой из расчета 0,1 г на 10 мл мо­лока). При убое самцов (баранов и др.) исследуют пораженные ткани органов — семенники с придатками.

Бактериологическая диагностика бруцеллеза проводится по общеприня­тому принципу — микроскопия, высев на питательные среды для выделения и изучения чистой культуры, биопроба (заражение морских свинок).

Микроскопия. Из каждой пробы патматериала готовят два мазка-отпечатка из тканей органов или два мазка из жидкого материала (истечения), высушивают, фиксируют над пламенем. Один препарат окрашивают по Граму, другой — спе­циальным методом (по Козловскому; Шуляку — Шину или Стампу). Мазки, при­готовленные из осадка молока (сливок), после центрифугирования перед окрас­кой следует обезжирить смесью Никифорова. Бруцеллы — мелкие, палочко - или кокковидной формы бактерии, длиной 0,6—1,5 мкм, в диаметре — 0,3—0,5 мкм; неподвижные, спор не образуют, рас­полагаются в мазке изолированно, попарно или небольшими скоплениями, куч­ками.

Грамотрицательные.

Окраска по методу Козловского. Фиксированные препараты окрашивают свежеприготовленным 2 %-ным водным раствором сафранина при подогревании до появления паров (2 минут). Мазок быстро промывают водой и докрашивают 1 %-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 1 минут, затем его про­мывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют: бру­целлы — красные, остальные микробы — зеленые.

Культуралъные свойства. Для выделения бруцелл делают посевы на специальные питательные среды: мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночно-глюкозно-глицериновый агар и бульон (ПГГА, ПГГБ), картофельный агар, эритрит-агар или сывороточно-декстрозный агар и др.

Посев исследуемого материала в жидкие и на плот­ные питательные среды проводят пастеровской пипеткой в несколько пробирок или чашек Петри. При исследовании молока полагается предварительно его центрифуги­ровать (300 об/мин 30 минут). Затем осадок высевают на агаровую среду в чашках Петри, содержащую бактериостатическое вещество, например в среду Козловского (МППА с глюкозой и краской — генциан фиолетовый или малахитовая зелень). За­сеянные среды помещают в термостат при +37—38 °С на 30 дней. Следует учиты­вать что В. abortus в первых генерациях растет при пониженном содержании 02. По­этому половину посевов из пат. материала от крупного рогатого скота культивируют при обычных условиях, другую половину (и все посевы при выделении В. ovis) — в атмосфере, содержащей 10—15 % углекислоты (в эксикаторах). Все посевы про­сматривают через сутки, затем через каждые 3—4 дня. Рост бруцелл проявляется через 7—10—30 и даже 40 дней. По мере адаптации к питательным средам рост культуры может появиться на 2—3-й день. На плотных питательных средах рост бруцелл проявляется мелкими прозрачными выпуклыми, округлыми, блестящими колониями с гладкой (S-формы) поверхностью и голубова­тым оттенком (встречаются и R-формы). При более длительном культивировании ко­лонии мутнеют, с появлением пигмента — темнеют, сливаются. В жидких питатель­ных средах рост бруцелл проявляется вначале равномерным помутнением и образо­ванием пристеночного кольца голубоватого оттенка; впоследствии образуется незна­чительный осадок. При обнаружении роста из типичных колоний готовят мазки, ок­рашивают специальными методами и просматривают под микроскопом. Затем пере­севают на плотную питательную среду и культивируют при тех же условиях.

Культу­ры идентифицируют по тинкториальным, морфологическим, культуральным свойст­вам. Кроме того, ставят РА на предметном стекле с позитивной бруцеллезной сыво­роткой, разведенной 1:50 и 1:2 (для выявления слабо агглютинирующих культур). Первичную культуру Br. ovis надлежит подвергнуть серологической идентификации - чистой выделенной культурой гипериммунизируют кроликов, затем их сыворотку исследуют в РДСК с антигеном Br. ovis (овисный антиген).

Биопроба осуществляется заражением морских свинок (параллельно с по­севами материала на питательные среды), которых предварительно подвергают серологическому контролю посредством РА (должен быть отрицательный ре­зультат в разведении сыворотки 1:5). Суспензию из ткани органов, содержимого желудка плода (1:10 в физрастворе) в дозе 1 мл, осадка после центрифугирования проб молока с добавленными сливками из верхнего слоя — 2—3 мл вводят мор­ской свинке подкожно с внутренней стороны бедра. Свинка не погибает. На 15— 25-й и 40-й день после заражения у свинок исследуют пробы сывороток крови пробирочным методом РА в разведениях от 1:10 до 1:80. При получении положи­тельных результатов морских свинок убивают и из органов делают посевы на пи­тательные среды с целью выделения культуры бруцелл. При выделении культуры возбудителя или получении положительного результата РА в титре 1:10 и выше лабораторный диагноз бруцеллеза считают установленным.

Все выделенные культуры бруцелл после их идентификации уничтожают автоклавированием при 1,5 атм в течение 1 часа. При необходимости определения вида бруцелл выделенную культуру на­правляют в областную (или республиканскую) лабораторию или в НИИ, имею­щие разрешение на работу с особо опасными инфекциями, где и определяют ферментативную (биохимическую) активность чистой культуры и учитывают дифференциальные признаки бруцелл.

Биохимические свойства. Желатину и свернутую сыворотку бруцеллы не разжижают, индол не образуют, сероводород и аммиак образуют в зависимости от вида и штамма. Молоко не свертывают, образуют каталазу. Ферментируют глюкозу, арабинозу, декстрозу, левулезу и др. с образованием кислоты.

Для дифференциации видов бруцелл используют чистые культуры (в S-форме). Наличие диссоциации культуры бруцелл определяют путем реакции термоагглютинации, пробы с флавакридином, окраской колоний кристаллвиоле-том. Посредством последнего метода устанавливают: если после внесения пасте­ровской пипеткой в культуру, выросшую в чашке Петри, краски в разведении 1:2000, приготовленной ex tempore (ее отсасывают из чашки через 5 минут), ко­лонии, просматриваемые под лупой, окрашены в темно-фиолетовый цвет,— культура диссоциированная. Если же колонии зеленого цвета или светло-желтого, значит, культура недиссоциирована (S-форма). Из типичных S-форм колоний микроорганизмы пересевают на скошенный МППА (в пробирках) и вы­росшую культуру идентифицируют по показателям.

Серологическая диагностика бруцеллеза осуществляется посредством про­бирочной РА, РСК, РДСК, розбенгал-пробы (РБП) с сыворотками крови исследо­вания молока с помощью кольцевой реакции (КР), ИФА, ПЦР.

Схема бактериологического исследования на бруцеллез

Контрольные вопросы:

1. Принципы диагностики бруцеллеза животных в лаборатории

2. Правила и техника отбора проб материала, направляемого для микробиолога ческой диагностики бруцеллеза

3. Порядок проведения бактериологического анализа патологического материала для диагностики бруцеллеза

4. Методы идентификации бруцелл, их патогенность

5. Постановка биопробы при лабораторной диагностике бруцеллеза

6. Методы серологической диагностики бруцеллеза, ее практическое значение

1.8 Тема: Возбудитель сибирской язвы

Цель занятия: Освоить правила взятия и пересылки патологического материала для лабораторного исследования на сибирскую язву, а также методы микроско­пического и серологического (РП) исследования патологического материала на сибирскую язву.

Задание:

1. Приготовить мазки-отпечатки из ткани органов трупов мышей

2. Окрасить по Граму

3. Окрасить Михину

4. Просмотреть под микроскопом и зарисовать в тетрадях микро­картину.

5. Приготовить посевы из сердца, печени или селезенки в пробирки с

6. МПБ, МПА, МПЖ.

Материалы и оборудование: Трупы белых мышей, зараженных вакцинным штаммом возбудителя сибирской язвы; стерильные наборы инструментов для вскрытия (ножницы, пинцеты, шпатели); питательные среды в пробир­ках (МПБ, скошенный МПА), стерильные пастеровские пипетки; преципитационныё пробирки в штативах; преципитирующая сибиреязвенная сыво­ротка, нормальная сыворотка (для контроля), стандартный сибиреязвенный антиген; физраствор, воронки для фильтрации, асбестовая вата. Для демон­страции необходимы таблицы по морфологическим и культуральным свой­ствам В. anthracis и биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 13, спорообразующие Г “+” палочки

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Bacillaceae;