Микробиология и вирусология (стр. 3 )

Задание:

1. Просмотреть посевы, определить культуральные и морфологические особенности.

2. Учет результатов записать в тетради.

3. Изолированные колонии стафилококков пересеять на среды для определения

биохимических свойств.

4. Окрасить готовые фиксированные мазки из гноя и готовые мазки - отпечатки из

патологического материала.

5. Сделать посевы на сывороточный МПБ и глюкозно-кровяной МПА.

Материалы и оборудование: Посевы на питательных средах, произведенные на предыдущем занятии; питательные среды для определения ферментативных свойств стафилококков и стрептококков (полужидкий агар с маннитом и индика­тором BP, лактозой, глюкозой, молоко простое, молоко с метиленовым синим, МПЖ); пробирки с цитратной плазмой кролика, МПА в колбе с рН 8,4—8,6, рас­твор натриевой соли ДНК (20 мг/мл) в стерильной дистиллированной воде с не­сколькими каплями 2 %-ного NaOH (сохраняется до 40 дней при 4 °С), раствор хлористого кальция (в ампулах), стерильные чашки Петри, кровяной МПА в чаш­ках, чистые культуры стафилококка, маститного стрептококка и пневмококка.

Классификация:

Отдел – Firmicutes

Секция – 12, грамположительные кокки.

Класс - Schizomycetes

Порядок – Eubacteriales

Семейство – Lactobacillaceae

Род – Streptococcus.

Виды – Str. pyogenes, Str. agalactiae, Str. equi, Str. pneunoniae, Str. faecalis.

Рис. 2 Стрептококк. Электронная микроскопия.

Стрептококки — в природе существуют патогенные и непатогенные стрептококки. Патогенные гемолитические стрептококки, как правило, вызывают инфекционные процессы, сопровождающиеся образованием гноя, по­этому их нередко называют гноеродными. Род стрептококков включает более 20 видов. Из патогенных чаще встречаются Str. pyogenes, Str. agalactiae, Str. equi, Str. pneumoniae. К непатогенным стрептококкам относятся молочнокислые и некото­рые другие (Str. lactis, Str. cremoris, Str. salivaris и др.). Разные виды патогенных стрептококков при их росте на кровяном агаре проявляют неодинаковый тип ге­молиза: ά-гемолиз — колонии зеленовато-серые, вокруг непрозрачная зеленая зона вследствие того, что гемоглобин переходит в метагемоглобин; β-гемолиз — вокруг колонии образуется прозрачная зона гемолиза. Непатогенные стрептокок­ки (Str. anhaemolyticus) гемолитическими свойствами не обладают.

Возбудитель инфекционного мастита коров — Str. agalactiae (Str. mastitidis).

При проведении бактериологического исследования учитывают, что хотя мастит коров может быть обусловлен различными видами микроорганизмов (стрептококками, ста­филококками, кишечной палочкой, синегнойной и др.), но специфическое значение в этиологии мастита имеет Str. agalactiae, реже золотистый стафилококк. Клинически выраженный мастит установить легче, бактериологическим исследованием устанавливают возбудителя, что облегчает более точный подбор лечебных средств.

Особое значение имеет распространение в хозяйствах скрытого (субклини­ческого) мастита, нередко предшествующего клиническому проявлению заболе­вания. С целью профилактики явных маститов диагностирование скрытого мас­тита представляет практическую необходимость.

Патологическим материалом для лабораторной диагностики клинически выраженного мастита служит измененный секрет из пораженной доли вымени. Его берут из каждого соска в отдельные стерильные пробирки. Для диагностики субклинического мастита первые порции молока не используют, их сдаивают в отдельную посуду; соски обмывают, дезинфицируют 70 %-ным спиртом, из каж­дого соска сдаивают в отдельные стерильные пробирки небольшое количество паренхимного молока (последние порции), закрывают пробкой. Молоко положе­но исследовать не позже двух часов с момента взятия проб.

Микроскопия фиксированных тонких и окрашенных по Граму мазков из присланного материала позволяет определить морфологические и тинкториальные свойства микроорганизма.

Str. agalactiae располагается длинными цепочками из сплюснутых кокков. Диаметр кокков 0,5-1 мкм. Грамположительные. При окраске мазка по Романовскому — Гимзе или метиленовым синим (Леффлера) выявляют и под­считывают клеточные элементы — фагоциты (увеличенное количество лейкоци­тов в молоке свидетельствует о воспалении молочной железы).

Рис. 3. Streptococcus agalactiae окраска по Граму.

Стрептококки неподвижные, споры и капсулы не образуют. В мазках из культуры с плотной питательной среды цепочки маститного стрептококка короткие.

Культуральные свойства. Оптимальный рН питательных сред для агалактийного стрептококка 7,6—7,8. Хорошо растет в обычных средах, но лучше с до­бавлением кровяной сыворотки или дефибринированной крови. Оптимальная температура роста +37— 38 °С. В сывороточном МПБ растет в виде крупинчатого осадка на дне пробирки (при сохранении прозрачности среды). На сыворо­точном МПА рост стрептококка проявляется в виде сероватых просвечиваю­щихся мелких колоний.

Ферментативные (биохимические) свойства. Патогенные стрептококки биохимически малоактивны. Агалактийный стрептококк не разжижает МПЖ, не редуцирует и не свертывает метиленовое молоко. В лакмусовом молоке происхо­дят свертывание и кислотообразование (через 24—36 часов) с частичным обес­цвечиванием лакмуса. Ферментирует углеводы: лактозу, мальтозу, сахарозу, глюкозу. Для маститного стрептококка характерно изменение финального рН в глюкозном бульоне в сторону кислотности до 4,4—4,7. Сорбит и дульцит не ферментирует. Диагностическим показателем для агалактийного стрептококка является гидролиз гиппурата натрия. Кроме того, для дифференциации агалактийного стрептококка от других стрептококков применяют CAMP (КАМП)-метод, получивший свое название но первым буквам фамилий авторов, австралийских исследователей (Кристи, Аткинс, Мунх-Петерсон). Метод основан на усилении гемолитической активности стрептококка группы В в зоне, близкой к полосе гемолиза стафилококка на кро­вяном агаре; гемолитические, но утратившие или снизившие гемолитическую ак­тивность штаммы агалактийного стрептококка образуют заметную зону гемолиза вблизи стафилококка. Другие виды стрептококков не проявляют гемолиза в усло­виях САМР-пробы. Для постановки САМР-пробы на кровяной агар в чашках Петри бактериологической петлей по диаметру засевают в виде полоски гемоли­тический стафилококк. Отступив на 2—3 мм, перпендикулярно к стафилококку петлей высевают штаммы стрептококков (3—4), на сутки помещают в термостат (+37 °С). Кроме того, идентификацию агалактийного стрептококка можно прово­дить с помощью реакции диффузионной преципитации в агаровом геле, а также методом флуоресцирующих антител. Установлено, что во всех случаях выделения агалактийного стрептококка (или стафилококка), как правило, в пробах молока, отмечаются высокое содержа­ние лейкоцитов, ослабление лизоцимной активности, положительная проба Уайт-сайда (косвенный показатель лейкоцитоза), положительная бромтимоловая проба (проба на щелочность молока реактивными бумажками).

Патогенность определяют биопробой на лабораторных животных: внутрибрюшинно заражают белых мышей, морских свинок.

Возбудитель мыта — Streptococcus equi.

Мыт лошадей – это контагиозное заболевание цельнокопытных животных, главным образом молодых лошадей в возрасте от 6 месяцев до 1—2 лет. Болезнь характеризуется катарально-гнойным воспалением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, глотки, подчелюстных лимфоузлов (клинически проявляется образованием абс­цессов, истечением из носа).

Патологический материал. Для бактериологического исследования в лабораторию направляют гной из абсцессов, гнойное носовое истечение, воспалительный экссудат. Учитывают, что в закрытых абсцессах стрептококк должен содержаться в чистом виде, поэтому асептически сделанный прокол абсцесса для взятия экссудата и посева его на питательные среды обеспечивает сразу получение чистой культуры.

Исследование проводят по общей схеме: 1) микроскопия препаратов-мазков из поступившего материала; 2) посев на питательные среды для выделения чистой культуры возбудителя и ее идентификации; 3) биологическая проба на белых мышах и котятах.

Микроскопия. Мазки готовят тонким слоем, особенно из гноя, часть из них окрашивают по Граму, часть — по Романовскому-Гимзе. В мазках из гноя S. equi располагаются длинными цепочками сплюснутых кокков. В препаратах-мазках из бульонной культуры цепочки чаще бывают короткие. В мазках из культур с плотной средой преобладают короткие цепочки и даже в виде диплококков. S. equi окрашивается грамположительно, неподвижен, спор не образует. Величина отдельных кокков 0,4-1 мкм.

Культуральные свойства. Мытный стрептококк требователен к питатель­ным средам: растет с добавлением сыворотки или дефибринированной крови, в среде Кита — Тароцци. В жидких средах растет в виде крупинок на дне и стен­ках пробирки, бульон остается прозрачным. Для выделения чистой культуры производят пластинчатый посев на сывороточно-глюкозный агар. На сывороточно-глюкозном агаре рост проявляется мелкими сли­зистыми колониями, просвечивающимися, как капли росы. Характерно сливание колоний между собой. На свернутой сыворотке образует желтовато-серые стек­ловидные колонии. На кровяном агаре рост в виде мелких колоний с зоной β-гемолиза.

Биохимические свойства. Отличительной особенностью мытного стрепто­кокка является его небольшая биохимическая активность: молоко не свертывает, лакмус и метиленовый синий не редуцирует (не обесцвечивает), не сбраживает лактозу, сорбит, маннит, что позволяет дифференцировать его от других стрепто­кокков. S. equi не растет в присутствии мытного антивируса (фильтрат 20-дневной бульонной культуры мытного стрептококка), в то время как все осталь­ные виды стрептококков растут.

Биопроба: Чувствительны кошки, особенно котята, кролики. Патогенность S. equi проверяют путем подкож­ного или внутрибрюшинного заражения белых мышей или кошек (лучше котят). Эти животные очень чувствительны — у мышей развивается пиемия (3—10 дней), затем наступает гибель. Котята гибнут от подкожного заражения минимальными дозами - одной десятимиллионной (1:10 000000) миллилитра бульон­ной культуры.