Микробиология и вирусология (стр. 22 )

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воз­духе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влаж­ную камеру при 37 °С на 25—30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, спо­ласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, нано­сят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуорес­цирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток.

В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.

Отрицатель­ным считают результат при отсутствии специфической флуоресцен­ции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и

т. д., а также материал, име­ющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле. Метод основан на свойстве ан­тител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспери­ментальной инфекции (биопроба).

Схема РДП при диагностике бешенства:

Рис. 1 А и В — левое и правое полушария мозга; С и Д—левый и правый аммоновы рога; Е — мозжечок; Ж— продолговатый мозг

1, 2, 3, 4 — разведения антирабического глобулина

Методика постановки. Реакцию ставят на предметных стек­лах, на которые наливают 2,5—3 мл расплавленного 1,5%-ного раствора агара. После застывания в агаре делают лунки диаметром 4—5 мм по трафарету, помещенному под предметное стекло с ага­ром. Агаровые столбики вынимают ученическим пером. Лунки в агаре заполняют компонентами по схеме (рис. 1).

От крупных животных исследуют все отделы головного мозга (левой и правой стороны), от средних (крысы, хомяки и др.) — ка­кие-либо три отдела мозга, у мышей — весь мозг. С помощью пин­цета из мозга готовят пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки.

Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят на отдельном стекле по тому же трафарету.

После заполнения лунок компонентами препараты помеща­ют во влажную камеру и ставят в термостат при 37 °С на 6 ч, за­тем при комнатной температуре — на 18 ч. Учет результатов ве­дут в течение 48 ч.

Реакцию считают положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунка­ми, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-гло­булин.

Бактериальная нестерильность и загнивание мозга не препят­ствуют использованию его для РДП. Материал, консервирован­ный глицерином, формалином и другими средствами, для РДП непригоден.

Выявление телец Бабеша - Негри. На пред­метных стеклах делают тонкие мазки или отпечатки из всех отде­лов головного мозга (как для РИФ), не менее двух препаратов с каждого отдела мозга, и окрашивают по одному из методов (по Селлерсу, Муромцеву, Ленцу и т. д.).

Окраска по Селлерсу: на свежий, невысохший препа­рат наносят краситель (одна часть 1%-ного раствора основного фуксина, смешанная с двумя час­тями 1%-ного метиленового синего), покрывая им весь препарат, выдерживают 10—30 сек. и смы­вают фосфатным буфером (рН 7,0—7,5), высушивают в вертикальном положении при комнатной температуре (в затемненном месте) и просматривают под микроско­пом с масляной иммерсией.

Положительным результатом считают наличие телец Бабеша-Негри — четко очерченных овальных или продолговатых гранули­рованных образований розово-красного цвета, расположенных в ци­топлазме клеток или вне их.

Данный метод имеет диагностическое значение только при обна­ружении типичных специфических включений.

Биопроба. Она более эффективна по сравнению со всеми указанными выше методами. Ее ставят при получении отрица­тельных результатов предыдущими методами и в сомнительных случаях.

Для биопробы отбирают белых мышей массой 16—20 г, нервную ткань из всех отделов головного мозга растирают в ступке со сте­рильным песком, добавляют физиологический раствор до получения 10%-ной суспензии, отстаивают 30—40 мин и используют надосадочную жидкость для заражения мышат. При подозрении на бакте­риальное загрязнение добавляют на 1 мл суспензии 500 ЕД пеницил­лина и стрептомицина и выдерживают 30—40 мин при комнатной температуре.

На одну биопробу заражают 10—12 мышат: половину интрацеребрально по 0,03 мл, половину подкожно в область носика или в верхнюю губу по 0,1—0,2 мл.

Зараженных мышат помещают в стеклянные банки (лучше ак­вариумы) и наблюдают за ними в течение 30 дней, ведя ежеднев­ную регистрацию. Гибель мышей в течение 48 ч считают неспеци­фической и не учитывают в оценке результатов. При наличии ви­руса бешенства в патматериале с 7—10-го дня после заражения у мышей наблюдают следующие симптомы: взъерошенность шер­сти, своеобразную горбатость спины, нарушение координации движений, паралич задних, затем передних конечностей и гибель. У павших мышей головной мозг исследуют в РИФ на обнаружение телец Бабеша — Негри и ставят РДП.

Биопробу на бешенство считают положительной, если в пре­паратах из мозга зараженных мышат обнаруживают тельца Ба­беша—Негри или выявляют антиген методами РИФ или РДП.

Отрицательный диагноз — отсутствие гибели мышат в течение 30 дней.

Рекомендуют для ранней диаг­ностики методом биопробы (осо­бенно это важно, когда исследуе­мое животное покусало человека) использовать для заражения не 10—12 мышат, а 20-30 и начи­ная с третьего дня после зараже­ния ежедневно забивать по 1— 2 мышонка для исследования их головного мозга в РИФ. Это по­зволяет (в положительных случа­ях) сократить срок исследования на несколько дней.

В лабораторной практике иногда ставят метод так называ­емой специфической биопробы. Сущность его в том, что мыши заболевают при заражении моз­говой тканью больных бешен­ством животных и не заболевают, если эту ткань предваритель­но обработать антирабической сывороткой (10 мин при 37 °С). Обычно в лаборатории проводят исследование в следующей пос­ледовательности: из головного мозга делают мазки-отпечатки для РИФ и обнаружения телец Бабеша-Негри, ставят РДП, при получении отрицательных результатов делают биопробу.

При высококвалифицированном выполнении РИФ получают 99— 100 % совпадения с биопробой. Тельца Бабеша — Негри выявляют лишь в 65—85 % случаев бешенства, в РДП — 45 - 70 %.

Контрольные вопросы:

1 Морфология и структура вирусов оспы.

2 На каком принципе основан вирусоскопический метод?

3 Как проявляется оспа у овец и кур?

4 Как проводят биопробу при оспе овец?

5 Как проводят биопробу при оспе кур?

6 Культивирование и выделение вируса оспы кур.

2.3 Тема: Лабораторная диагностика ящура

Цель занятия: Изучить методы лабораторной диагностики и освоить технику постановки РСК при определении эпизоотических типов вирусов ящура.

Задание:

1. Изучить методы лабораторной диагностики ящура.

2. Приготовить антиген для РСК из патматериала, взятого от больных животных.

3. Поставить гл. опыт РСК с целью определения типовой принадлежности вируса ящура.

4. Провести учет реакции и дать заключение.

Оборудование и материалы: Стандартные биофабричные специфические сыворотки и антигены типов А, О, С, САТ, Азия, гемолизин, комплемент, 2 %-ная взвесь эритроцитов барана, штативы, пробирки или доски с луночками из плексигласа, мерные пипетки, физиологический раствор, биопрепара­ты.

Содержание занятия:

Ящур - остропротекающая высококонтагиозная болезнь парнокопытных, прояв­ляющаяся лихорадкой, афтозным поражением слизистой ротовой полости, языка, реже кожи вымени и конечностей. При злокачественной форме отмечается тяжелое поражение миокарда, которое у телят часто заканчивается летально.

Наиболее восприимчивы к заболеванию ящуром крупный рогатый скот, затем свиньи, овцы, козы. Болеют ящуром все виды парнокопытных животных.

Рис. 20 Макет вириона ящура.

Источник возбудителя – больные животные, которые выделяют вирус во внешнюю среду уже в инкубационный период, вирусоносителями переболевшие животные являются свыше 400 дней. Во внешнюю среду вирус выделяется со слюной, молоком, калом, мочой и др. Особенно богата вирусом слюна. Из факторов передачи наибольшее значение имеет перенос возбудителя с одеждой людей, средствами транспорта, кормами, строительными материалами и т. д. из очагов заболевания.

Заражение животных происходит преимущественно через слизистые оболочки ротовой полости, поврежденную кожу вымени и конечностей и аэрогенно.

Диагностика базируется на основе учета эпизоотических особенностей болезни (почти 100% заболеваемость животных, быстрое распространение и т. д.), очень характерных для этого заболевания клинических признаков и результатов лабораторных исследований. При проведении лабораторных исследований обязательно следует определить тип и вариант вируса ящура, вызвавшего заболевание. Это важно для подбора вакцин. Возбудителем ящура является наиболее мелкий вирус размером 20—30 пм, входящий в семейство пикорнавирусов, в род афтовирусов. Вирионы округлой формы. Внутренняя часть представлена одноцепочной положительной РНК, заключенной в капсид, состоящей из 32 капсомеров. Внешняя оболочка отсутствует. Вирусы ящура устойчивы к эфиру, хло­роформу, спирту, но быстро инактивируются в кислой среде и при нагревании, хорошо пе­реносят низкие температуры.

Особенностью вируса является вариабельность антигенной структуры. В настоящее время известно более 60 антигенных вариантов вируса, входящих в 7 основных типов (А, О, С, CAT - I, САТ-2, САТ-3, Азия). При диагностике ящура большое значение имеют клини­ческие, патологоанатомические и эпизоотологические данные и типизация вируса в сероло­гических реакциях.