Микробиология и вирусология (стр. 8 )

Ферментативные свойства. Производят посев культуры на среды Гисса с углеводами. Обычно P. multocida ферментирует глюкозу, сахарозу, маннит, сорбит с образованием кислоты без газа; не ферментирует лактозу и дульцит. Редуцирует нитраты, является продуцентом индола, не образует уреазу, не обладает гемолитической активностью, не разжи­жает желатину, не свертывает и не пептонизирует молоко. Редукцию нитратов определяют путем выращивания культуры в МПБ с 0,1 % KN03 в течение 1—2 суток, затем в пробирку с культурой пастерелл добавляют 2—3 капли реактива Гисса. В положительном случае появляется фиолетово-красное окрашивание среды. Образование индола определяют общепринятыми способами с использо­ванием 3—4-суточной культуры в бульоне Хоттингера или Мартена. Каталазоположительные.

Биопроба. Заражение лабораторных животных проводят с целью выделения чистой культуры возбудителя или испытания ее вирулентности. Исследуемым материалом от крупного рогатого скота, свиней, овец заражают белых мышей и кроликов, от птиц — голубей, кур, уток. Голубям суспензию материала вводят внутримышечно в дозе 0,3 мл, белым мышам и кроликам подкожно в дозе 0,2 мл первым и 0,5 мл — вторым. Кроликов перед заражением исследуют на пастереллоносительство. С этой целью кроликам вводят по 2 капли 0,5 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени в течение трех дней до заражения. Появление гнойного истечения из носовой полости свидетельствует о пастереллоносительстве. Носителей исключают из опыта. При наличии в патологическом материале пастерелл перечисленные виды животных погибают в течение 18—36 часов. При испытании вирулентности вы­деленных культур пастерелл проводят подкожное заражение бульонной культу­рой в тех же дозах голубей, белых мышей или кроликов.

Положительный бактериологический диагноз на пастереллез ставят при выде­лении из патологического материала культур грамотрицательных, капсулообразующих, неподвижных палочковидных бактерий, редуцирующих нитраты, образующих индол, обычно расщепляющих глюкозу, сахарозу, сорбит и маннит, не обладающих гемолитической активностью и вирулентных для лабораторных животных.

Туляремия – природно-очаговая острая инфекционная болезнь животных и человека, характеризующуюся лихорадкой, параличами у молодняка, увеличением лимфатических сосудов и абортами.

Классификация:

Отдел – Gracilicutes;

Секция – 4, грамотрицательные аэробные палочки и кокки.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Brucellaceae;

Род – Francisella;

Вид – Francisella tularensis.

Возбудитель туляремии — Francisella tularensis. У домашних животных чаще протекает в септической форме и характеризуется увеличением подкожных лим­фатических узлов, нервными явлениями; у крупного рогатого скота может про­являться маститами, у лошадей — абортами. В естественных условиях к возбуди­телю туляремии восприимчивы грызуны (около 40 видов), насекомоядные, реп­тилии, амфибии и др. Из сельскохозяйственных животных наиболее вос­приимчивы ягнята, поросята, цыплята.

Патологический материал. При жизни животного исследуют пунктат из увеличенных лимфатических узлов, от абортированного плода или плод целиком, мочу, фекалии; после гибели животного — печень, почки, селезенку, уве­личенные лимфоузлы от крупных животных, трупы грызунов и других мелких животных. При необходимости патматериал можно консервировать в растворе глицерина или в смеси стерильного вазелинового масла с парафином (25 мл мас­ла и 2,5 мл парафина).

Все работы по выделению и идентификации возбудителя туляремии можно проводить только в лабораториях со специальным режимом для особо опасных инфекций.

Микроскопия. Мазки-отпечатки, приготовленные из патологического мате­риала, окрашивают по Граму и по Романовскому — Гимзе в течение 1—1,5 часов или разведенным фуксином. Необходимо помнить, что обнаружить возбудителя туляремии можно только при обильном обсеменении патологического материала. F. tularensis — мелкая грамотрицательная коккоподобная бактерия в мазках из культуры, и тонкая палочка — в препаратах из органов. Величина 0,03-0,7 х 0,2-0,4 мкм. Споры не образует, неподвижная. В организме животного образует нежную капсулу (не всегда). По Романовскому — Гимзе окрашивается в розово-голубой цвет, часто биполярно.

Культивирование. F. tularensis — аэроб, температурный оптимум +37—38 °С, оптимальный рН 6,7-7,4. Культуры возбудителя выделяют посевом на спе­циальные питательные среды: свернутую желточную среду Мак-Коя, шоколад­ный агар Френсиса, кровяную среду Емельяновой.

Среда Мак-Коя: на 60 частей куриных желтков добавляют 40 частей сте­рильного физиологического раствора (дистиллированную воду для физраствора подщелачивают до рН 7,6—7,2). Для свертывания среды ее выдерживают при +80 °С 1 часов. Среда Френсиса: к МПА с 1 % пептона и 0,5 % NaCI (рН 7,3) добав­ляют 0,1 % цистина и 1 % глюкозы, кипятят несколько минут, затем охлаждают до +50 °С и добавляют 10 % дефибринированной, стерильно полученной крови кролика. Среда Емельяновой: в рыбно-дрожжевой агар вносят 0,1 % цистина и 1 % глюкозы. Затем агар расплавляют, охлаждают до +45°С, к нему добавляют 10 % дефибринированной крови, разливают по чашкам Петри или в пробирки. Дан­ная среда наиболее чувствительна.

Методом прямых посевов культуры возбудителя туляремии можно выде­лить только от грызунов (мыши, крысы и др.). Из организма сельскохозяйственных животных и пушных зверей возбудителя выделяют биологическим методом путем 2—3 «слепых» пассажей через высокочувствительных животных (белых мышей, морских свинок). Посев на твердые среды проводят путем прикладыва­ния к поверхности среды небольшого кусочка ткани, взятого из глубины иссле­дуемого материала, тканевой сок втирают в поверхность среды. На средах с кро­вью через 1—2 дня культивирования появляются мелкие колонии беловатого цвета с голубоватым оттенком, круглые, выпуклые с ровна, краями, гладкие, блестящие. На жидких средах F. tularensis растет плохо. При культивировании следует учитывать, что типичной формой колонии является S-форма, об­ладающая Vi - и О-антигенами, вирулентная и иммуногеная.

R-форма F. tularen­sis содержит лишь 0-антиген и авирулентна.

Биохимические свойства выражены слабо, но на специальных питательных средах с пониженным содержанием белка F. tularensis ферментирует с образова­нием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, маннозу, глицерин, декстрин. Обладает протеолитическими свойствами, расщепляет белки с образованием сероводорода. Индол не образует.

Биопроба основана на заражении белых мышей и морских свинок суспен­зией, растертых тканей патологического материала подкожно и внутрибрюшинно (в дозе 0,5 мл). Белые мыши погибают на 3—4-й день (иногда 8—12-й), морские свинки — через 4—5 дней. Если в материале мало клеток возбудителя, гибель животных возможна на 8—15-й день. При вскрытии трупов отмечают некротиче­ские очаги в легких, селезенке, печени, лимфатических узлах; из внутренних ор­ганов делают посевы с целью выделения культуры возбудителя, которую иден­тифицируют в пробирочной РА. В качестве антигена используют 2-суточную культуру, выращенную на среде Мак-Коя. Микробную массу снимают петлей (смывать нельзя), суспендируют в физиологическом растворе, доводят концен­трацию до 5 млрд микробных клеток в 1 мл по стандарту для туляремийного микроба. Микробную взвесь в дозе 0,5 мл вносят в пробирки со специфической сывороткой в разных разведениях, не менее чем до 1:20000, встряхивают, поме­щают на 2 часа в термостат, затем оставляют при комнатной температуре на 20— 22 часа. Положительным результатом считают четко выраженную агглютинацию при полной прозрачности жидкости над агглютинатом. Для быстрого обнаружения возбудителя в органах и тканях исследуемого животного применяют РСК или РП. В качестве антигена используют экстракт из тканей поступившего в лабораторию трупа животного (грызуны, пушные звери).

Контрольные вопросы:

1. Особенности морфологии и тинкториальных свойств пастерелл.

2. Культуральные и ферментативные свойства пастерелл.

3. Значение биопробы в диагностике пастереллеза.

4. Схема бактериологического исследования на пастереллез.

5. Биопрепараты: вакцины, лечебно-профилактические сыворотки.

6. Морфология, тннкториальные, культуральные свойства возбудителя туляремии.

7. Патогенные свойства возбудителя туляремии

8. Питательные среды, применяемые для культивирования F. Tularensis. Культуральные и биохимические свойства возбудителя туляремии.

9. Бактериологическая и серологическая диагностика туляремии.

1.7  Тема: Возбудитель бруцеллеза

Цель занятия: Ознакомить студентов с правилами отбора проб материала от жи­вотных, его упаковки и пересылки в лабораторию, а также с методами бактерио­логических и серологических исследований материала на бруцеллез.

Задание:

1. Приготовить мазки из патологического материала;

2. Окрасить по Грамму;

3. Окрасить по Козловскому;

4. Просмотреть под микроскопом, микрокартину зарисовать в тетради;

5. Поставить розбенгал-пробу;

6. Поставить кольцевую реакцию с молоком.

Материалы и оборудование: Растворы красителей для окраски по методу Козлов­ского, сыворотки крупного рогатого скота — позитивная (бруцеллезная) и нор­мальная в пробирках по 1 мл и те же сыворотки под разными номерами (шифра­ми) — испытуемые, бруцеллезный антиген для розбенгал-пробы и антиген бру­целлезный для кольцевой пробы с молоком; молоко коровье, свежее — отдельно пробирки с молоком от здоровых животных и пробирки с молоком от коров, больных бруцеллезом (содержащие антитела), по 2 мл в каждой; пробирки соот­ветственно помечены № 1 и 2; пипетки градуированные стерильные емкостью 1 и 0,1 мл (количество пипеток в зависимости от количества студентов в группе); пластины с луночками для постановки розбенгал-пробы, пробирки со взвесью бруцелл (антиген) и в смеси с бактериями других видов в физрастворе (сальмо­неллы или мезентерикус), вакцинный штамм микроба сибирской язвы и пробирки по 10 мл с физраствором. Для демонстрации необходимы таблицы (морфология бруцелл); пробирки с агаровой культурой бруцелл, залитые парафином (вак­цинный штамм); микроскопические препараты — мазки, окрашенные по методу Козловского и по Граму; в мазках — бруцеллы в смеси с другими бактериями; пробирки с положительной и отрицательной кольцевой реакцией с молоком; био­препараты.