Микробиология и вирусология (стр. 14 )

Для биологической пробы используют кроликов, белых мышей. Кроликов заражают подкожно (сбоку) или методом аппликации патоло­гического материала в подкожный, препарированный специально «кармашек» с наружной стороны уха. Кролики гибнут через 1—2 месяцев, мыши — через 8— 14 дней.

Для выявления атипичных форм некробактериоза разработана РСК с анти­геном — экстрактом 3-дневной культуры F. necrophorum в печеночном бульоне. Титр антигена 1 : 40. Обнаружить бактерии некроза можно и методом флуоресцирующих антител.

Контрольные вопросы:

1. Характеристика возбудителя столбняка, принцип и порядок проведения

микробиологической диагностики.

2. Материал для диагностического исследования на ботулизм.

3. Материал и бактериологическая диагностика фузариобактериоза (некробактериоза).

1. 11 Тема: Возбудители туберкулеза и паратуберкулеза

Цель занятия: Ознакомить студентов с правилами взятия проб материала, его упаковки и пересылки в лабораторию, с методами обработки (подготовки) пат. материала для бактериологического исследования. Усвоить методы бактерио­логического анализа поступившего в лабораторию материала.

Задание:

1. Изготовить 3 препарата-мазка: 2 из смеси микобактерий - один из них окра­сить по Граму, другой - методом Циль-Нильсена, третий мазок из культуры М. Phlei, окрасить методом Циль-Нильсена;

2. Все мазки просмотреть под микроскопом, микрокартину зарисовать в тетради;

3. Культуру M. Phlei засеять на среду Петраньяни и среду со стрептомицином, а для контроля - в пробирки с обычным МПБ и МПА;

4. Просмотреть готовые окрашенные демонстрационные препараты.

Материалы и оборудование: Пробирка со смесью взвеси убитых микобактерий туберкулеза и любых некислотоустойчивых бактерий, пробирка с чистой культу­рой палочки тимофеевой травы (Mycobacterium phlei), пробирка со средой Пет­раньяни, пробирка с глицериновым МПБ, пробирка со средой, содержащей стрептомицин. Для демонстрации необходимы таблицы, готовый препарат-мазок микобактерий туберкулеза, окрашенный по методу Циля - Нильсена; культура микобактерий на среде Петраньяни и на глицериновом картофеле (в запаянных пробирках Ру); биопрепараты.

Классификация:

Отдел – Firmicutes;

Секция – 16 – микобактерии;

Порядок – Actinomycetales - нитевидные, ветвящиеся клетки;

Семейство – Mycobacteriaceae;

Род – Mycobacterium;

Виды – M. tuberculosis – возбудитель туберкулеза человека; M. bovis – туберкулез крс;

M. avium – туберкулез птиц; M. paratuberculosis – возбудитель паратуберкулеза;

M. leprae – возбудитель проказы.

Возбудитель туберкулеза. Наибольшее значение в патологии сельскохозяйственных животных (и человека) имеют следующие виды микобактерий: Mycobacterium tuberculosis, М. bovis и М. avium.

Туберкулез — инфекционное, хронически протекающее заболевание человека, животных, в том числе и птиц. Патологоанатомически он характеризуется образовани­ем в различных тканях и органах специфических очагов-бугорков (туберкул), по мере развития процесса подвергающихся творожистому перерождению.

Патологический материал для бактериологического исследования направля­ют как при жизни животного (истечения из носа, бронхиальную слизь, молоко — особенно при увеличении надвыменных лимфоузлов, фекалии, реже мочу), так и посмертно (пораженные части органов с туберкулами и лимфоузлы — бронхиальные, заглоточные, средостенные, предлопаточные, надвыменные). Труп птицы (или тушку) на­правляют целиком — исследуют пораженные печень, селезенку, легкие, яичники. При взятии патологического материала необходимо соблюдать правила асептики, личной профилактики и технику безопасности. Материал в лабораторию доставля­ют свежим. Если нет условий соблюдения этого, то лимфоузлы, кусочки тканей ор­ганов консервируют в 30—40 %-ном водном растворе глицерина или посылают в замороженном состоянии. Обсемененность исследуемого материала микобактериями туберкулеза может быть незначительной. Поэтому, чтобы повысить концентра­цию возбудителя в пробах (для большей достоверности результатов исследования), применяют специальные методы обработки и обогащения.

Мокроту, слизь, гной заливают равным объемом 10 %-ного раствора трех-замещенного фосфата натрия, хорошо перемешивают и ставят в термостат на 24 часа. Затем центрифугируют при 3000 об/мин 10—15 минут. Исследуют осадок.

Пораженные ткани нарезают мелкими кусочками и растирают в стериль­ной ступке с 6%-ной серной кислотой в соотношении 1 : 4, фильтруют через два слоя марли, центрифугируют, кислоту отсасывают, к осадку добавляют физрас­твор, вновь встряхивают и центрифугируют. Так промывают 2—3 раза. Промы­тый осадок высевают на питательные среды и готовят мазки.

Молоко — всю пробу (150 мл) центрифугируют при 3000 об/мин 20—30 минут. Осадок обрабатывают 6 %-ным раствором" серной кислоты, промывают физраствором, центрифугируют. Исследуют осадок и слой сливок.

Маcло (2—4 г) вносят в стерильную пробирку, заливают горячей водой, за­крывают резиновой пробкой, встряхивают 5—10 минут, перевертывают пробирку вверх дном, ставят в штатив, оставляют в прохладном месте. Когда масло засты­нет осторожно приоткрывают пробку, жидкость выливают в центрифужные про­бирки, далее исследуют, как молоко.

Фекалии. (50 г) растирают в стерильной ступке с 18%-ным раствором сер­ной кислоты, фильтруют через марлю, центрифугируют, исследуют осадок, как в предыдущих случаях.

Помимо описанной методики обработки материала (по Маккавейской), рекомендуется также готовить материал по методу Венота и Моро: 2—4 г фекалий растирают в ступке, разбавляют 25%-ным раствором NaCI до жидкой консистенции, фильтруют через марлю, затем в центрифужную пробирку вносят 5 мл фильтрата, добавляют 1 мл петролейного эфира или авиационного бензина, перемешивают, плотно закрывают корковой пробкой и центрифугируют 15—25 минут. Из нижней части образовавшегося на поверхности кольца берут материал для исследования.

Концентрирование микобактерий осуществляют также методом флотации. Исследуемый материал подготавливают, как обычно. Затем в колбу с узким гор­лом вносят 10 мл материала, добавляют 10 мл 1 %-ного раствора NaOH, плотно закрывают и встряхивают 10 минут. После этого взвесь разводят 1:10 дистилли­рованной водой, добавляют 1— 2 мл ксилола (петролейного эфира или бензина), вновь встряхивают 5—10 минут, доливают дистиллированную воду до уровня горлышка колбы и выдерживают 30 минут при комнатной температуре. Всплыв­шие капельки ксилола (эфира, бензина) увлекают за собой микобактерий, образуя флотационное кольцо, содержимое которого исследуют. Подготовленный после обработки поступивший материал исследуют.

Микроскопия. Возбудитель туберкулеза относится к группе кислото-спирто-щелочеустойчивых бактерий, что обусловлено наличием стеариновых кислот (миколовой, пионовой) и других воскоподобных веществ на поверхности клетки (в се оболочке). Эти вещества придают микробной клетке гидрофобность, то есть способность отталкивать воду и водные растворы красителей, кислот, щелочей. В связи с этим бактерии туберкулеза (и паратуберкулеза) трудно воспринимают краску. Для окрашивания бактерий этой группы применяют специальные методы, среди которых наиболее распространенным является метод Циля — Нильсена. После окраски этим методом микобактерий приобретают розово-красный цвет, по Граму окрашиваются положительно.

Для микроскопического исследования патологического материала реко­мендован также люминесцентный метод. Метод обладает высокой чувствительностью, дает цветное изображение объекта (золотисто-желтый цвет).

Окраска препаратов по Поляковой: маз­ки из обогащенного материала, подготовленного к посеву, или непосредственно из тканей органов фиксируют на пламени. Окрашивают специальным раствором (0,1 г аурамина, 0,01 г родамина С, 100 мл дистиллированной воды) 10—15 ми­нут, осторожно промывают водой. Затем обесцвечивают 3 %-ным раствором со­ляной кислоты в 70 %-ном этиловом спирте в течение 15— 30 секунд и промы­вают водой. После этого гасят фон мазка раствором следующего состава: 1 г ки­слого фуксина, 1 г ледяной уксусной кислоты, 500 мл дистиллированной воды, воздействуя им на мазок 1—2 минут, промывают водой и дополнительно гасят фон метиленовым синим (синькой Леффлера) 2 минут. Промывают водой, сушат на воздухе. Просматривают под сухой системой микроскопа (Х40).

Возбудитель туберкулеза — бактерия палочковидной формы, длина 1,5—5 мкм, диаметр 0,5 мкм. М. tuberculosis — тонкая, слегка изогнутая палочка, М. bovis — короткая и толстая, М. avium — мельче остальных видов, обладает по­лиморфизмом. Микобактерий туберкулеза неподвижные, спору и капсулу не об­разуют. В мазках из исследуемого материала располагаются одиночно и неболь­шими скоплениями. В мазках из культуры, помимо одиночных бактерий, встре­чаются длинные нити с разветвлениями. Часто обнаруживаются неравномерность в окрашивании, наличие вцитоплазме зернистости (грамположите-льные некислото­устойчивые «зерна Муха»).

Культивирование и культуральные свойства. Микобактерии туберкулеза способны размножаться в строго аэробных условиях на соответствующих элективных питательных средах. Рост медленный (2— 4 недели и доль­ше). Культивируют при +37 °С (иногда в термостате выдерживают до 3 мес). На­личие роста в посевах учитывают каждые 2—3 дня в течение первых 10 дней, за­тем каждые 5 дней. Предварительно обработан­ный исследуемый материал высевают на питательные среды — элективные (из­бирательные): яично-крахмальные, картофельные с глицерином и краской для за­держания роста посторонних микроорганизмов. В диагностической лабораторной практике широко используется среда Пет­раньяни: 150 мл молока, 6 г картофельного крахмала, 1 г пептона, одна небольшая картофелина, нарезанная на мелкие кусочки. Все это нагревают 10 минут в водяной бане при помешивании и оставляют в ней на 1 час (продолжая помешивать) для ох­лаждения до +50 °С.

Затем добавляют целиком четыре яйца и один желток, 12 мл глицерина, 10 мл 2 %-ного водного раствора малахитовой зелени. Все тщательно пе­ремешивают, фильтруют через марлю, разливают по пробиркам и в наклонном поло­жении дробно стерилизуют в аппарате Коха (при этом происходит свертывание мас­сы среды) — первый день при +80 °С 20 минут, второй и третий дни — при +75 °С по 15 минут. Замена пептона аспарагином повышает ценность среды.