Микробиология и вирусология (стр. 25 )

Сыворотку реконвалесцентов применяют подкожно телятам из расчета 1.5 мл на 1 кг живого веса. Она обеспечивает пассивный иммунитет длительностью 8-12 дней. С этой целью можно использовать и кровь реконвалесцентов, но только в день ее получения.

Вместо сыворотки можно применять противоящурный иммунолактон, представляю­щий высушенные компоненты сыворотки молока коров, иммунизированных внутривымянно.

Контрольные вопросы:

1 Как протекает ящур у животных?

2 Структура вириона вируса ящура.

3 Антигенная вариабельность.

4 Особенности иммунитета.

5 Правила взятия и транспортировки афтозного материала для диагностики и типирования вируса ящура.

6 Подготовка ящурного антигена для РСК.

7 Сущность РСК.

8 Компоненты РСК.

9 Как производят титрацию гемолизина?

10 Как готовят гемолитическую систему?

11 Порядок и последовательность главного опыта РСК.

12 Учет результатов главного опыта РСК.

13 Применение РДП и РН для типизации вируса ящура.

14 Методы специфической профилактики ящура

2.4 Тема: Лабораторная диагностика парагриппа-3 крупного рогатого скота

Цель занятия: Освоить РТГА при ретроспективной диагностике парагриппа крупного рогатого скота.

Задание: Индикация вируса парагриппа-3 в культуре клеток и его идентификация в РЗГАд.

Оборудование и материалы: Доски с луночками из плексиглаза, мерные пипетки на - 1, 2, 5 мл., резиновые баллончики с наконечником, изотонический раствор натрия хлорида, антиген ПГ-3, испытуемые сыво­ротки крови, 1%-ная взвесь эритроцитов морских свинок, набор сухих диагностикумов для диагностики парагриппа-3 крупного рогатого скота, банки с дезраствором, таблицы.

Содержание занятия:

Парагрипп крупного рогатого скота - острое контагинозное заболевание телят, чаще 2-3 месячного возраста, характеризующееся поражением респираторного тракта. Возбудителем является вирус, имеющий близкое антигенное родство с вирусом парагриппа человека 3-то типа. Парагриппозные вирусы человека и животных входят в семейство и род парамиксовирусов. Они состоят из оболочки и внутреннего компонента, представляющего однонитевую рибонуклеопротеидную спираль, свернутую в клубок (РНП). Оболочка покрыта многочис­ленными шипами, расположенными радиально. Они представляют специфические белки, обеспечивающие гемагглютинирующие, гемолизирующие свойства и нейраминидазную ак­тивность вирусов. Кроме того в оболочке содержится фактор Ф, вызывающий симпластообразование в клеточных культурах, а также аденозинтрифосфатаза, белковые и липидные компоненты клетки хозяина.

род: Paramyxovirus

cемейство: Paramyxoviridae

РНК - геномный вирус

Предварительная клинико-эпизоотологичес-кая диагностика представляет большие трудности, так как симптомы этой болезни имеют сходство с аденовирусной инфекцией, ринотрахеитом, вирусной диареей крупного рогатого скота и др. Кроме того, парагрипп часто протекает в виде смешанной инфекции совместной бактериями и микоплазмами. Поэтому точный диагноз можно установить только с помощью лабораторных методов исследования, основных по идентификации вируса парагриппа - 3 с помощью набора сухих диаг­ностикумов.

Парагрипп у крупного рогатого скота диагностируют комплексно на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов обязательного лабораторного исследования. Клинико-эпизоотологические и патологоанатомические признаки служат лишь основанием для постановки предположительного диагноза, поскольку сходные с парагриппом симптомы отмечаются при ряде других болезней. Окончательный диагноз устанавливают только после результатов вирусологических и серологических исследований.

Взятие и подготовка вируссодержащего материала:

1 Носоглоточная слизь. Взятие слизи производят в начале болезни путем протирания носовых ходов и задней стенки глотки сухим стерильным тампоном.

2 Кусочки слизистых оболочек носовых раковин, трахеи, глотки, легочной ткани.

Данный материал лучше брать от больных животных, убитых с диагностической целью. За­мораживание и хранение материала быстро инактивируют вирус парагриппа - 3, поэтому рекомендуется испытуемый материал помешать в термос с обычным льдом и немедленно доставлять в лабораторию. Вируссодержащую суспензию готовят по общепринятой методи­ке.

Порядок исследования:

Лабораторная диагностика включает:

1)  обнаружение антигена в патологическом материале (мазках, отпечатках, срезах), полученном от больных животных, в РИФ;

2)  выделение возбудителя из патологического материала в культуре клеток и его идентификацию в РТГА, РНГАд, РИФ и др.;

3)  выявление антител в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РТГА.

1 Обнаружение специфического антигена в эпителиальных клетках слизистой носоглотки методом иммунофлуоресценции.

2 Выделение вируса из патматериала и его идентификации в РТГА, РЗГАД.

3 Ретроспективная диагностика.

Иммунофлуоресценция. Вирусы парагриппа созревают на поверхности клетки и медленно освобождаются от нее, поэтому отторгаемые в ходе воспалительного процесса эпителиальные клетки содержат специфический вирусный антиген или зрелые вирионы. При подготовке препаратов сухим тампоном собирают слизь со слизистой носоглотки больных животных и делают мазки на предметных стеклах, которые обрабатывают люминесцирующей специфической сывороткой по общепринятой методике. При парагриппозной инфекции свечение антигена наблюдают в цитоплазме клетки.

Выделение и идентификация вирусов

Выделение вирусов производят путем заражения первично - трипсинизированных культур клеток почек эмбрионов коров. Наблюдения ведут в течение 15-18 дней, периоди­чески просматривают с целью обнаружения ЦПД и ставят тест гемадсорбций с 0,5%-ной взвесью эритроцитов морских свинок. При отсутствии гемадсорбций проводят пассажирование культуралъной жидкости и клеток до появления положительного результата. Если в течение 5 пассажей гемадсорбция не будет наблюдаться, то результат считают отрицатель­ным. При появлении четкой гемадсорбции производят заражение свежих клеток культур вируссодержащей суспензией для постановки реакции задержки гемадсорбций (РЗГАД).

Постановка РЗГАД

В пробирки с выращенным монослоем вносят по 0,2 мл вирусной суспензии, а затем 1 мл поддерживающей питательной среды и выдерживают в термостате при 37°С 5 дней. После чего монослой отмывают раствором Хенкса и в каждые 3 пробирки вносят по 0,2 мл гипериммунной специфической сыворотки 1:10 и 0,6 мл раствора Хенкса, а в 3 контрольные пробирки - по 0,8 мл раствора Хенкса, выдерживают 20 мин. при комнатной температуре монослоем вниз. Во все пробирки вносят по 0,2 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки и выдерживают еще 30 мин. Результат учитывают после легкого встряхивания. В пробирках, где вирус нейтрализован специфической сывороткой, гемадсорбция не наблю­дается.

При идентификации вирусов парагриппа используют также РТГА. В качестве антиге­на берут культуральную жидкость из тех пробирок с клеточной культурой, где отмечается четкая гемадсорбция эритроцитов морской свинки.

Ретроспективная диагностика

Данный метод основан на выявлении прироста антигемагглютинирующих антител в парных сыворотках крови. Первый раз кровь у животных берут в начале заболевания, а затем через 2-3 недели и одновременно исследуют в РТГА. Перед исследованием сыво­ротки подвергают освобождению от термостабильных ингибиторов, используя каолино­вый метод или СО2, и термолабильных. В последнем случае пробы прогревают при 56°С в течение 30 мин.

РТГА ставят аналогично, как это делают при идентификации вируса.

Четырехкратный и большой прирост титра антител во второй сыворотке по сравне­нию с первой указывает на активный инфекционный процесс в организме, вызванный тем вирусом, на который в организме вырабатываются антитела.

СХЕМА РТГА

	Разведение сыворотки	Конт-	Конт	Контроль антигена
							роль	роль
Компоненты	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	испы	эритро-	2	1	0,5	0,25
							туем	цит	ГАЕ	ГАЕ	ГАЕ	ГАЕ
							сыво-	морс.
							ротки	свинок
А	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Изотонический
раствор МаСЬ, мл	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,4	0,2	0,2	0,2	0,2
Испытуемая сыворотка		Последовательный		0,2	0,2	-	-	-	-	-
1-5 мл	0.2	перенос по 0,2 мл		в дездез.
						р-р
Антиген 4 ГАЕ	0,2	0,2		0,2	0,2	0,2	0,2			Перенос по 0,2 в дез. р-р
экспозиция 30 мин при комнатной температуре
1%-ная взвесь эри -
эритроцитов морских	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
морск. свинок, мл
Учет результатов через 30 минут
Результаты	-	-	-	-	++	+++	-	-	+++	++	-	-

Результат считают положительным в том случае, если титр антител возрастает в 4 и более раз.