Микробиология и вирусология (стр. 7 )

Культуральные свойства. Е. coli хорошо растет на всех широко используе­мых в лабораторной практике питательных средах. Оптимальная температура роста 37—380С, рН среды 7,0—7,2. По типу дыхания — аэроб (и факульта­тивный анаэроб). В жидкой среде рост эшерихий проявляется в виде равномерно­го помутнения среды с образованием легко разбивающегося осадка. На МПА че­рез 16—20 ч вырастают влажные, круглые колонии с ровными краями и гладкой поверхностью, серовато-белого цвета. Существуют штаммы Е. coli, обладающие гемолитическими свойствами (вокруг колонии на кровяном агаре проявляется зона гемолиза). Для установления родовой и видовой принадлежности культур большое значение имеет выявление биохимических свойств. С этой целью чистую культу­ру высевают на ряд специальных сред. На среде Эндо в чашках coli образует 2 типа колоний: темно-вишневого цвета с металлическим блеском и малиново-красные с розовым ободком. На среде Левина колонии темно-фиолетовые или черные.

Ферментные (биохимические) свойства. Это объясняется тем, что кишечная палочка сбраживает лактозу, содержащуюся в среде, при этом образуется молочная кислота, под действием которой происходит восстановление цвета фуксина, также входящего в состав среды, но обесцвеченного сульфитом натрия. Глюкозные и лактозные среды с индикатором Е. coli сбражива­ет, и среда в пробирках становится розового или красного цвета. Встречаются лактозонегативные штаммы (сероварианты) Е. coli, не сбраживающие лактозу. Многие штаммы ферментируют маннит, дульцит. Е. coli образует индол, не образует H2S, дает положительную реакцию с метиловым красным (среда окрашивается в розо­во-красный цвет) и отрицательную реакцию Фогеса — Проскауэра (среда окра­шивается в желтый цвет). Последние две пробы ставят с двухсуточной культу­рой, выращенной на среде Кларка (раствор пептона, глюкозы, двухфосфорнокислого калия в дистиллированной воде). В пробирку с культурой на среде Кларка пипеткой добавляют 5 капель спиртового раствора метилового красного, пробир­ку встряхивают. При ферментации глюкозы происходит розовое окрашивание, при отсутствии ферментации углевода — желтое окрашивание, отрицательный результат. В другой пробирке с культурой на среде Кларка проводят пробу Фогеса — Проскауэра: добавляют 0,2 мл 40 %-ного КОН и 0,5 мл 6 %-ного спиртового раствора альфа-нафтола, учитывают результат через 3—5 минут. Если культура сбраживает глюкозу с образованием ацетилметилкарбинола, последний с инди­катором дает розовое окрашивание, положительный результат. На жидкой синте­тической среде Козера и плотной среде Симмонса с индикатором бромтимолблау Е. coli не растет потому, что не усваивает цитратно-аммонийные соли сред. Е. coli желатину не разжижает, мочевину не расщепляет.

Родовую дифференциацию семейства Enterobacteriaceae проводят на основе культурально-морфологических и биохимических свойств бактерий. Учитывая, что биологические свойства разных штаммов эшерихий неодинаковы, в связи с их различной вирулентностью и антигенной структурой выделенную из иссле­дуемого материала чистую культуру подвергают серологической типизации в РА, используя набор типоспецифических агглютинирующих 0-колисывороток.

Антигенное строение Е. coli. Клетка содержит три вида антигенов: О — соматический, К— оболочечный, капсульный и Н— жгутиковый. О-антиген термостабильный, расположен в клеточной стенке, состоит из липидо-полисахаридо-протеинового комплекса. К-антиген - это кислый полисахарид, реже протеины. Н-антиген - белковой природы, термолабильный.

Патогенность Е. coil (при проведении бактериологической диагностики) определяют внутрибрюшинным заражением молодых белых мышей массой 13— 15 г. Хотя белые мыши малочувствительны к Е. coli, но в большинстве случаев эти микробы, выделенные из органов трупов (или из фекалий) больных колиинфекцией животных, патогенны для мышей. Е. coli, выделенные от здоровых животных (и людей), обычно непатогенны. Патогенность для белых мышей зави­сит от вирулентности штамма, дозы вводимых бактерий, веса (возраста) мышей, метода заражения и индивидуальной иммунологической реактивности, а также от условий кормления и содержания.

Характеризуя биологические свойства Е. coli, следует отметить, что у пато­генных штаммов отмечается продуцирование двух типов токсинов — термола­бильного экзотоксина и термостабильного эндотоксина. Имеются штаммы Е. coli (как патогенные, так и непатогенные), продуцирующие антибиотические вещест­ва — колицины, подавляющие рост некоторых других штаммов эшерихий и не действующие на бактерий других видов. Колицины термостабильны.

Помимо общепринятого метода микробиологической диагностики, исполь­зуют и некоторые дополнительные ускоренные методы:

- реакция нейтрализации антител (РН),

- реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), позволяющая обнаружить возбудителя болезни в фекалиях больных жи­вотных.

- люминесцентная серодиагностика – используют как ориентировочный метод для определения патогенных серотипов кишечной палочки при массовых вспышках желудочно-кишечных заболеваний. Этот метод позволяет в кратчайшие сроки получить предварительный результат.

- фагодиагностика.

- ИФА.

- ПЦР.

- иммунохроматографический анализ.

Контрольные вопросы:

1. Патологический материал для бактериологической диагностики колибактерио­за.

2. Морфология, тинкториальные и культурально-биохимические свойства Е. coli

3. Дифференциально-диагностические среды, применяемые для выделения и

идентификации Е. coli.

4. coli для лабораторных животных.

1.6 Тема: Возбудители пастереллёза и туляремии

Цепь занятия: Освоить правила отбора и пересылки патологического материала для бактериологического исследования на пастереллез. Изучить морфологиче­ские, культуральные и биохимические свойства возбудителя пастереллеза. Озна­комиться с биологическими препаратами, применяемыми для специфической профилактики и лечения пастереллеза, а также с методами микробиологической диагностики туляремии.

Задание:

1. Приготовить мазки из культуры P. multocida на МПА и МПБ;

2. Окрасить препараты по Граму, синькой Леффлера, микроскопировать и зари­совать в тетради;

3. Сделать препарат "раздавленная капля" с P. Multocida;

4. Вскрыть трупы мышей зараженных P. Multocida, произвести посевы на МПА и МПБ из крови, сердца, селезенки, печени, приготовить препараты из них и ок­расить по Граму

5. Окрасить и просмотреть под микроскопом готовые препараты с F. tularensis.

Материалы и оборудование: Культуры P. multocida на МПА, МПБ, 0,3 % МПА в пробирках, на МПА и кровяном агаре в чашках Петри, в МПБ с 0,1 % KN03; тру­пы белых мышей, зараженных P. multocida; культуры P. multocida на средах Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, сорбитом; реактивы Гисса и Эрлиха; по­кровные стекла, стерильные пастеровские пипетки, стерильные питательные сре­ды: МПБ и скошенный МПА в пробирках; биопрепараты — вакцины и сыворот­ки против пастереллеза; туляремийный антиген для РА и позитивная сыворотка; готовые фиксированные мазки F. tularensis (туляремийныи антиген для РА).

Классификация:

Отдел – Gracilicutes;

Секция – 5, грамотрицательные факультативные анаэробы.

Порядок – Eubacteriales;

Семейство – Pasteurellaceae/ Brucellaceae;

Род – Pasteurella;

Виды – Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica.

Возбудитель пастереллёза (геморрагическая септицемия) — Pasteurella multocida. Пастереллезом болеют многие виды сельскохо­зяйственных животных. Болезнь характеризуется явлениями септицемии и воспа­лительно-геморрагическими процессами во внутренних органах, на серозных и слизистых оболочках. Наличие множественных точечных геморрагий (кровоизлияний) – есть характерный патологоанатомический признак. Лабораторная диагностика основывается на выделении культуры возбудителя и изучении ее свойств.

Патологический материал. Для бактериологического исследования от крупных животных в лабо­раторию направляют печень, селезенку, почку, лимфоузлы, кровь из сердца, трубчатую кость. Трупы мелких животных – целиком. В летнее время и при пересылке на дальнее расстояние органы помещают в 30 %-ный водный раствор глицерина, а трубчатую кость заворачи­вают в марлю или вату, пропитанные 5—10 %-ным раствором формалина.

Морфология и тинкториальные свойства P.multocida. Препараты-отпечатки высушивают, фиксируют и окрашивают часть по Граму, часть по Романовскому-Гимза, или синькой Лёффлера, разведенным фуксином. В мазках-отпечатках из органов и крови, окрашенных по Граму, пастереллы выявляется в виде грамотрицательных мелких коротких палочковидных бактерий с закругленными концами (0,3x1.5 мкм), овоидной формы. Споры не образует. Многие вирулентные свежевыделенные штаммы формируют капсулу, которая при окраске специальными методами легко выявляется. P. multocida не обладает подвижностью. При окраске синькой Леффлера или по Романовскому-Гимза пастереллы имеют вид биполяров (интенсивно окрашены концевые участки бактериальной клетки, центральная часть окрашена очень слабо). В мазках из культур пастереллы представляют собой коккобактерии или короткие палочки, расположенные одиночно, попарно, иногда в виде коротких цепочек.

Культуральные свойства. P. multocida — аэроб, факультативный анаэроб, темпе­ратурный оптимум +37—38 °С, оптимальный рН 7,2—7,4. Посевы из исследуе­мого материала производят на МПА, МПБ, но лучше на обогащенные пи­тательные среды - кровяной МПА, сывороточный МПА или МПБ, бульон Хоттингера или Мартена. Посевы инку­бируют 24—48 часов. При отсутствии роста возбудителя на плотных средах по­севы целесообразно выдерживать до 4—5 суток. На МПА пастереллы растут в виде мелких, выпуклых, прозрачных, круглой формы колоний, которые флуорес­цируют или создают радужность в косопроходящем свете (S-форма), что связано с капсулообразованием. Иногда возбудитель формирует бо­лее крупные слизистые (М-форма) или шероховатые колонии (R-форма). Гемоли­тической активностью P. multocida не обладает. В МПБ пастереллы растут с рав­номерным помутнением среды и образованием на дне пробирки слизистого осад­ка, поднимающегося при встряхивании в виде «косички» (S-форма); мукоидные штаммы растут более интенсивно и дают массовый слизистый осадок, диссоции­рованные пастереллы (R-форма) не вызывают помутнения среды, а на дне про­бирки образуется мелкозернистый или хлопьевидный осадок. На МПЖ возбудитель растет вначале отдельными колониями, затем в виде белого стержня без отростков.