Микробиология и вирусология (стр. 15 )

Используют также среды Левенштейна — Йенсена, Гельберга и жидкую среду Школьниковой. Культивировать можно и на обычном картофеле, пропи­ИИи 3—4 %-ным глицерином, на глицериновом МПБ и МПА.

tuberculosis в глицериновом бульоне проявляется на поверхности среды в виде толстой складчатой пленки с широким пристеночным кольцом. На плотных средах рост обильный, колонии сухие бородавчатые или сморщенные, иногда в виде узелков, цвета слоновой кости (кремовый).

Рис. 16 Культура микобактерий на яичной среде Левенштейна-Йенсена

На среде Петраньяни колониисеровато-желтые. М. bovis растет в виде зеленоватых коло­ний на среде Петраньяни, в жидкой среде образует пленку тонкую, нежную, ино­гда сетчатую, не покрывающую всей поверхности среды. На плотных средах рост скудный, колонии сухие, мелкие, зернистые, серовато-белые. М. avium в жидких средах образует сначала сухую, затем ослизняющуюся пленку по всей поверхно­сти бульона. На плотных средах — влажный и слизистый налет. Колонии серова­то-белые или желтоватого цвета, по форме могут напоминать пуговицеобразное круглое возвышение, иногда кратеровидное углубление. На среде Петраньяни ко­лонии золотистые. М. avium растет быстрее, чем микобактерий остальных видов.

При исследовании мела, молока, воды следует учитывать возможность на­чни кислотоустойчивых сапрофитов (М. phlei и др.), которые растут на пита­тельных средах быстро по сравнению с патогенными микобактериями (4— 7 дней) Характерным для патогенных штаммов микобактерий является их особен­ность роста на средах в виде косичек, хорд (корд-фактор), что связано с наличием миколовой кислоты в клетках этих микобактерий.

При необходимости рекомендуется проводить ускоренное обнаружение микобактерий туберкулеза в посевах по методу Поляковой: готовят взвесь бактерийной массы в физрастворе NaCI концентрацией 10 мг/мл по оптическому стан­дарту для вакцины БЦЖ, и высевают петлей на стерильные полоски нитроцел-люлизных мембран, наложенные на поверхность среды Петраньяни (5 пробирок) таким образом, чтобы нижний конец полоски был опущен в конденсат. Инкуби­руют в термостате при +37—38 °С. На третий, седьмой и десятый дни культиви­рования стерильным пинцетом снимают по одной полоске, накладывают на предметное стекло, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают аурамин — родамином 15 минут. Затем осторожно промывают и просматривают под люми­несцентным микроскопом. Данный метод позволяет обнаружить микроколонии микобактерий туберкулеза в виде светящихся золотисто-оранжевых или зе­леновато-желтых скоплений через 10 дней и ранее. Кислотоустойчивые сапрофиты вырастают к 3—7-му дню, колонии видимы простым глазом (визуально).

Для дифференциации отдельных видов микобактерий ставят биопробу на морских свинках, кроликах, а при необходимости — на курах, предварительно проверенных аллергическим методом (туберкулинизацией) для исключения спонтанного туберкулеза. Для заражения применяют либо культуру, либо при­сланный в лабораторию материал, который предварительно обрабатывают серной кислотой, как указывалось выше, растирая в стерильной ступке. К осадку после центрифугирования добавляют 15 %-ный раствор двууглекислой соды, оставляют на 10—15 минут и вновь центрифугируют 5 минут. Образовавшийся осадок два­жды промывают стерильным физраствором с последующим центрифугировани­ем, а затем осадок вновь суспендируют в физрастворе, отстаивают 5—10 минут. Надосадочную жидкость вводят по 1—2 мл морским свинкам в паховую область, кроликам — внутривенно. У морских свинок в положительных случаях (патогенный штамм) через 2—3 недели на месте введения образуется уп­лотнение, потом язва с одновременным увеличением регионарных лимфоузлов. Этим свинкам через 2—3 недели подкожно инъецируют туберкулин (аллерген — фильтрат убитых автоклавированием микобактерий), что приводит к бурной ге­нерализации процесса и гибели животных.

При вскрытии из типичных туберкулов готовят мазки и делают высевы на питательные среды. М. bovis вызывает генерализованный процесс туберкулеза у кроликов и морских свинок. М. tuberculosis патогенен лишь для морских свинок, вызывая заболевание в период от 3 недель до 3 месяцев после заражения. М. avium, как правило, обусловливает у кроликов септический процесс без образо­вания специфических туберкулов и приводит к быстрой гибели животных (осо­бенно при внутривенном заражении).

При выделении слабовирулентных культур (и с атипичным ростом) микобактерии туберкулеза необ­ходимо дифференцировать от кислотоустойчивых сапрофитов, используя три теста. 1. Определение каталазной активности. В про­бирку с культурой на яичной среде вносят 50 %-ный раствор перекиси водорода так, чтобы была покрыта вся поверхность среды. С момента появления пузырьков газа учитывают результат. Хотя каталазной активностью обладают все кислото­устойчивые бактерии, у сапрофитов она выражена интенсивнее. 2. Определение формамидазной активности. Суспензию культуры с поверхности яичной среды обрабатывают растворами формамида, затем последовательно сернокислым мар­ганцем, феноловым реактивом и гипохлоридом кальция.

Появление си­него кольца указывает на положительную формамидазную активность, прису­щую кислотоустойчивым сапрофитам. 3. Определение лекарственной устойчиво­сти осуществляют с культурами, выросшими на питательных средах с добавле­нием различных концентраций туберкулостатических препаратов (стрептомицин, фтивазид, ПАСК и др.). Вирулентные штаммы М. tuberculosis и М. bovis, как пра­вило, чувствительны к действию этих препаратов. Между тем атипичные штам­мы, кислотоустойчивые сапрофиты и М. avium обладают резистентностью в от­ношении антитуберкулезных лечебных препаратов.

Возбудитель паратуберкулеза (паратуберкулезного эн­терита крупного рогатого скота по данной методике). — Mycobacterium paratuberculosis. Поражает преимущественно крупный рогатый скот, реже овец, верблюдов и очень редко коз и оленей. Паратуберкулез — хроническая инфекционная болезнь, характеризую­щаяся образованием отечно-воспалительных складок слизистого и подслизистого слоя пораженного отдела кишечника, снижением продуктивности и прогресси­рующим истощением.

Патологический материал направляют в лабораторию как при жизни жи­вотного (фекалии с комочками слизи и примесью крови, соскобы со слизистой оболочки прямой кишки), так и посмертно или при убое (пораженные участки кишечника, отрезок подвздошной кишки, перевязанный с двух сторон, мезентериальные лимфоузлы). Материал берут с соблюдением правил асептики, консер­вируют 30%-ным раствором глицерина (для гистологического исследования консервируют 10%-ным раствором формалина).

Бактериологический диагноз базируется в основном на микроскопировании препаратов, так как выделение чистой культуры возбудителя сопряжено с боль­ИИи трудностями. Биопробу при диагностике паратуберкулеза не проводят (ла­бораторные животные невосприимчивы). Поступающий в лабораторию патматериал подвергается обработке (подго­товке). Учитывая загрязненность посторонней микрофлорой, его предварительно очищают и концентрируют возбудителя, как и при диагностике туберкулеза.

Микроскопия. М. paratuberculosis — мелкая тонкая грамположительная па­лочка длиной 0,5—1,5 мкм, диаметром 0,2—0,5 мкм, неподвижная, споры и кап­сулы не образует, кислотоустойчивая. В препаратах-отпечатках располагается скоплениями (кучками), гнездами, редко одиночно или по 2—4 клетки. Отмеча­ется полиморфизм, палочки могут быть расширенными, напоминая контуры бутылки, ручной гранаты, иметь вид бесструктурных глыбок, мелких кокков. В мазках из культуры палочки длиннее, стройнее, менее скученные, в отдельных клетках видна зернистость.

В связи с тем, что выделение возбудителя паратуберкулеза из организма больного животного с фекалиями происходит периодически, при сомнительном или отрицательном результате микроскопии исследование повторяют. Кроме све­товой, можно пользоваться люминесцентной микроскопией препаратов — отпе­чатков из патологического материала или полученной чистой культуры, окра­шенных флуорохрамами по специальной методике.

Для выделения чистой культуры материал высевают на специальные пита­тельные среды (на общеупотребительных средах возбудитель паратуберкулеза не растет). Лучший рост наблюдают при добавлении к питательным средам вытяжки из убитых бактерий туберкулеза или кислотоустойчивых сапрофитов (М. phlei). Применяют модифицированную среду Дюбо—Смита: К2НР04— 1,0; Na2HP04— 6,25; MgS04—0,01; СаС12 г — 0,0005; ZnS04 — 0,0001; CuS04— 0,0001; лимон­нокислое аммонийное железо — 0,05, аспарагин— 1,0, гидролизат казеина—80 мл, спиртовой экстракт микобактерий флеи — 20 мл; сыворотка крупного рогато­го скота 20 %; пенициллин из расчета 50 ЕД на 1 мл среды и 15,0 агара Дифко; дистиллированная вода до 1000 мл. Перед посевом на питательные среды патоло­гический материал обрабатывают 5 %-ным раствором серной кислоты, промыва­ют физраствором, растирают в ступке и высевают на описанные среды или на среды Петраньяни и казеиновую с названным выше фактором роста. Посевы ста­вят в термостат при +38 °С, через 2 дня пробирки парафинируют.

Результат учитывают через 15 дней, затем каждые 5 дней. Рост просматри­вают с помощью лупы. Первичный рост на казеиновой среде отмечают к 18—20-му дню при сильной обсемененности засеваемого материала. При слабой обсеме­ненное™ — в более поздние сроки. На плотных (элективных) средах колонии плоские, сухие, серовато-беловатые, с неровными краями. По мере роста края приобретают бугристость, не отличаясь от колоний других видов микобактерий. В первичных культурах на среде Петраньяни рост отсутствует, что обычно учи­тывают при идентификации культур. В жидких средах (МПБ с глицерином, син­тетические среды) на поверхности образуется нежная беловатая пленка, которая в силу собственной тяжести опускается на дно.

Дифференциация возбудителя паратуберкулезного энтерита и возбудителя туберкулеза основывается главным образом на двух факторах: