Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 10 )

Путем скармливания эрготионеина S35 животным установлено, что некоторое его количество экскретируется в эякуляты. По предположению H. Heath и др. [217] большая часть эрготионеина в организме животных экзогенного происхождения, однако, биосинтез незначительного количества в организме авторами не исключается. По-видимому, отдельные животные имеют различную способность усваивать и накапливать эрготионеин в организме. Это мнение основано на достоверных различиях в содержании SΗ- групп в плазме эякулята, которое наблюдается между эякулятами отдельных хряков, находящихся в одинаковых условиях кормления, содержания и использования [218].

Имеется мнение, что содержание сульфгидрильных групп в плазме эякулята имеет индивидуальное различия. Это обусловлено различным содержанием в ней эрготионеина. По данным Т. Mann [188] в 100 мл эякуляте хряка содержится 66,5 мкМ сульфгидрильных групп. Эта величина хорошо согласуется последующими исследованиями и [214] которые нашли, что в 100 мл плазмы эякулята хряков-производителей содержится 66,2±2 мкМ сульфгидрильных групп.

Имеется данные о наличии в сперме и других тиоловых соединений. Наличие в сперме человека одного из наиболее распространенных тиолов – глютатиона в количестве 30 мг% впервые показал C. Infantellina [219]. Используя для определения глютатиона кадмиевый метод, и [220] нашли, что в эякуляте хряка содержится 28,1мг% восстановленного и 1,5мг% окисленного глютатиона, а в эякуляте барана - 58 мг% восстановленного и 3 мг% окисленного глютатиона в 1 млрд. половых клетках. Применяя аналогичный метод, , [221], [222] обнаружил в эякуляте хряка 25,35мг% общего глютатиона (окисленного и восстановленного).

Более поздными исследованиями установлено R. Slaweta [223], что уровень эндогенного глютатиона в эякуляте быков находится на уровне 28 нмоль на 109 клеток, а в плазме -26 мкМ/мкл. Высокий уровень восстановленного глютатиона в эякуляте быков, по мнению автора, связан со значительной активностью глютатионпероксидазы, находящейся в плазме эякулята. Установлена существенная положительная корреляция между уровнем глютатиона в половых клетках и количеством половых клеток с аномальной акросомой и утечкой из сперматозоидов аспаратаминотраноферазы. Обнаружена существенная отрицательная корреляция между уровнем восстановленного глютатиона в плазме эякулята и количеством половых клеток с аномальной акросомой из половых клеток аспаратаминотрансферазы. Эти же авторы показали, что сезон года сказывает значительное влияние на концентрацию глютатиона как в сперматозоидах, так и в плазме спермы.

1.1.10.3 Теоретические предположении о возможности использования тиоловых соединений для хранения и замораживания спермы животных

Ряд исследователи пытались использовать свойства сульфгидрильных групп для регуляции метаболизма сперматозоидов и улучшения качества эякулята с помощью различных разбавителей и тем самым улучшить технологию искусственного осеменения сельскохозяйственных животных путем продления способности оплодотворяющей способности сперматозоидов.

Впервые для этой цели был использован восстановленный глютатион. По данным H. Lardy, P. Phillips [224] восстановленный глютатион, не оказывает действия на синтез молочной кислоты сперматозоидов быка. В эксперименте были использованы половые клетки быка, отмытые от плазмы ресуспендированные в Рингер –фосфат-глюкозной среде. H. Lardy, P. Phillips [224] испытали действие на производство молочной кислоты добавок глютатиона в концентрации от 0,0002 до 0,003 моли.

Применив желточно -цитратный разбавитель с 0,05% цистеином, или 0,125% восстановленным глютатионом, для хранения половых клеток быков в течение 72 часов при температуре 40С, J. Nadroo и другие [225] не установили разницы в качестве живучести сперматозоидов.

По данным и , [214] введение в эякуляты хряков восстановленного глютатиона увеличивало ее переживаемость и оплодотворяющую способность сперматозоидов. Известно, что коровье молоко после нагревания может использоваться для разбавления эякулята сельскохозяйственных животных [226]. R. Flipse и др. [227] установлено, что непрогретое молоко содержит антистрептококковое вещество лактеин, которые токсичны для половых клеток животных. I. Hutton Poton S. [228] нашли, что при нагревании выше 800С SH - группы молока активируются и подавляют токсичность лактеина и становится пригодным для разбавления спермы животных.

Royd B. и др. проводя опыты с тиогликоевой кислотой [229] установили, что добавление к молоку реагента равноценно нагреванию до 920С. Такой же эффект с цистеином и глютатионом получен Jonhson L. [230] и другими исследователями [231]; [232]; [233]; [234] . При добавлении их к сперме быков, также улучшилась абсолютный показатель живучести сперматозоидов.

Предположение относительного изменения сульфгидрильных группы при замораживании спермы производителей в литературе имеются различные противоречивые взгляды [214]; [235]; [236]; [237]; [238]; и [239].

В частности [214] наблюдал, что замораживание нативной спермы хряков или отмытых от плазмы сперматозоидов а жидком азоте и последующее оттаивание приводит к необратимому прекращению подвижности сперматозоидов, значительному снижению активности дегидрогеназ и уменьшению определяемого количества сульфгидрильных групп в половых клетках в среднем 34%. Уменьшение определяемого количества SH- групп в половых клетках под влиянием замораживания зависит от исходного содержания этих групп в гаметах.

В то же время [235] утверждает, что в процессе технологической обработки эякулята при замораживании содержание SH - групп в нем остается практически неизменным.

и др. [240] проведены исследование количественного содержания SH - групп в плазме эякулята и мембранах половых клеток баранов при замораживании в жидком азоте (196 0С). Перед замораживанием эякуляты баранов их разбавляли в соотношении 1:2 0,25М сахарозой. Мембраны изолировали из свежеполученных и замороженных половых клеток. Авторами установлено, что около 96% от общего содержания сульфгидрильных групп эякулята баранов находятся в клетках и только 4% в плазме спермы. Причем 97-98% SH- групп половых клеток и плазмы связаны с протеином и всего лишь 2-3% встречаются в свободном ( несвязанном) виде.

Общее количество сульфгидрильных групп в цельном свежеполученном эякуляте баранов составило 21 мМ/мг, а в мембранах половых клеток - 147 мМ/мг белка, т. е. в 7 раз больше. По их мнению, замораживание вызывает уменьшение общего количества сульфгидрильных групп в эякуляте, в основном связанных с белком спермы. В мембранах снижение количества SH - групп происходит еще в большей степени. Авторы предполагают, что уменьшение количества сульфгидрильных групп в эякуляте и особенно в мембранах сперматозоидов при замораживании связано с криоповреждением половых клеток.

В целом. анализ приведенных выше литературных данных, несмотря на их противоречивость, позволяют сделать вывод о важной роли сульфгидрильных групп в метаболических процессах живых клеток, в том числе и сперматозоидах производителей.

Учитывая положительные теоретические стороны этих исследовании и с для совершенствования технологию искусственного осеменения свиней, нами решено провести детальное исследования сульфгидрильных групп спермы хряков-производителей, определить наличие или отсутствие связей между уровнем SH - групп и качеством спермы, изучить влияние тиоловых реагентов на жизнеспособность и оплодотворяющую способность спермиев с тем, чтобы использовать полученные результаты для разработки новой среды для криоконсервации спермы хряков производителей.

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Научно-производственные опыты проведены в 2009-2011 гг. в свиноводческих хозяйствах «Достык», «Дидар» и «Аксункар» Южно-Казахстанской области. Ряд анализов проведены в специализированных лабораториях Всероссийского НИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных – Россия, ТОО «Юго-Западного научно-исследовательского института животноводства и растениеводства» и в лабораториях Южно-Казахстанского государственного университета имени М. Ауезова.

Кормление свиней проводились с учетом возраста, живой массы и интенсивности использования в соответствии: ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма для свиней, ГОСТ 28001-88 Зерно фуражное и ОСТ 10125-96 Корма растительные.

Научно-исследовательская работа проведена по общей схеме исследования (рисунок 1). В опыте участвовало 12 хряков-производителей и 128 свиноматок крупной белой породы. Эксперименты проводили методом групп, который формировали по принципу аналогов с учетом возраста, живой массы и физиологического состояния животных.

В опытах проведенных Ленинградской области Российской Федерации использовали сперму хряков четырех пород: ландрас, дюрок, йокширская, и гемпшир+дюрок (ГД) в возрасте 8 месяцев - 2 –х лет, принадлежащих Гатчинского района Ленинградской области. Сперму получали мануально с помощью чучела при режиме использования 2-3 раза в неделю. При взятии спермы у хряков первую фракцию не использовали. Для осеменения использовали вторую и третью (не полностью) фракции. Подвижность сперматозоидов определяли при температуре 38-40ºС глазомерно и выражали в баллах от нуля до единицы. Сперму разбавляли средой BTS Pulver с гентамицином. Диализ спермы проводили в диализной камере, созданной в лаборатории воспроизводства и искусственного осеменения свиней ВНИИРГЖ. Сперма в диализной камере сохранялась при температуре 14-16 ºС в течение суток.

Подопытных животных кормили в соответствии с детализированными нормами, содержали в соответствии с принятой технологии регионов, обеспечивая требуемые нормативы микроклимата для хряков - производителей.

Качество эякулята оценивали по цвету, запаху, объему, концентрации, активности и абсолютному показателю переживаемости по общепринятым методикам и в соответствии с ГОСТ 20909.4. Определение подвижности спермиев и ГОСТ 20909.4. Определение выживаемости спермиев при температуре 37°С и Инструкциями [241].

Концентрацию сперматозоидов определяли в камере Горяева и выражали в млрд. на 1 мл спермы. Активность (процент поступательно-активных клеток) определяли микроскопированием капли семени при температуре 38...40°С и выражали в баллах от 1 до 10, что соответствует 10-100 процента.