Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 28 )

В плазме спермы хряков соотношение активности изоферментов после разбавления, эквилибрации и замораживания достоверно не меняется.

Рассматривание активности изоферментов выраженную в мкМ пировиноградной кислоты от общей активности ЛДГ представлены в табл. 29. Анализ таблицы 61 показывают, что при разбавлении спермы средой ГХЦЖКУ наблюдается увеличение активности всех изоферментов лактатдегидрогеназы по сравнению с контролем. Увеличение ЛДГ1 составило на - 2,5%; ЛДГ2 - 46,7%; ЛДГ3 - 29,1%; ЛДГ4 - 18,2% и ЛДГ5 на 19,1%.

Таблица 60- Соотношение изоферментов ЛДГ в сперматозоидах хряков до и после замораживания в средах

ГХЦЖК (контроль) и ГХЦЖКУ (опыт)

Сперма	Вариант	Общая активность ЛДГ в мкМ на 109 клеток	Активность изоферментов в %
ЛДГ1	ЛДГ2	ЛДГ3	ЛДГ4	ЛДГ5
После разбавления средой	Контроль	6,69±0,05	8,4±1,1	2,4±0,01	9,5±1,1	32,7±2,1	43,8±3,6	3,16
Опыт	787±0,09	7,8±1,3	2,8±0,01	9,8±1,2	31,8±1,9	44,4±3,1	3,16
Р	<0,01	>0,05	<0,01	>0,05	<0,01	>0,01
После эквилибрации	Контроль	5,36±0,02	6,2±0,8	3,0±0,02	8,4±0,9	33,2±2,7	45,2±3,5	3,53
Опыт	5,61±0,06	6,1±0,7	2,4±0,02	7,9±0,9	35,9±2,4	45,8±3,4	3,53
Р	<0,01	>0,05	<0,05	>0,01	<0,01	>0,05
Замороженно-оттаяная	Контроль	3,62±0,05	6,8±0,9	2,1±0,01	7,4±0,8	40,6±3,2	40,3±2,8	3,25
Опыт	5,02±0,04	5,1±0,8	3,0±0,02	6,8±0,8	39,5±3,2	42,9±3,6	3,37
Р	<0,05	>0,01	<0,01	>0,01	<0,01	>0,01

Наблюдается значительное снижение активность изоферментов после замораживания-оттаивания во всех группах (табл. 61). Однако следует заметить что, по сравнению с контрольной средой, в среде с унитиолом выше активность изоферментов сперматозоидов после замораживания-оттаивания. Так, активность изоферментов сперматозоидов ЛДГ1 на 8,7%; ЛДГ2 - 57,8%; ЛДГ3 - 24,2%; ЛДГ4 - 27,4% и ЛДГ5 на 49,3%. При сравнении этих разниц с разницами в активности изоферментов сперматозоидов после разбавления свежеполученной спермы можно обнаружить, что у криоконсервированной сперматозоидов значительно снижается некоторые изоферменты лактатдегидрогеназы. Эти разницы составляют по активности ЛДГ1 от 22,5% до 8,7%. В то же время у изоферменты лактатдегидрогеназы ЛДГ5 наблюдается увеличение этой разницы от 19,1% свежеполученного до 49,3% после замораживания-оттаивания. Это свидетельствует о том, что “анаэробный” изофермент ЛДГ5 при замораживании-оттаивании сперматозоидов в среде с унитиолом сохраняется лучше чем “аэробный” изофермент лактатдегидрогеназы ЛДГ1.

Несколько иная картина наблюдается с изоферментами плазмы спермы. После разбавления со средой ГХЦЖКУ в плазме спермы в опытных группах наблюдается увеличение активности изоферментов ЛДГ1, ЛДГ4 и ЛДГ5 Однако после замораживания-оттаивания сперматозоидов достоверной разницы между активностью изоферментов лактатдегидрогеназы между группами не наблюдается.

3.3.8 Исследование влияние совместного введения в среду унитиола и мочевины на активность лактатдегидрогеназы и ее изоферментов

Исследование влияние совместного введения в среду унитиола и мочевины на активность лактатдегидрогеназы и ее изоферментов проведены в весенние периоды. В среду добавляли унитиола концентрации 0,028%, а мочевину 0,30%. Результаты опытов представлены в таблицах 30 и 31. Замечено, что сезоны года в определенной степени влияют на активности лактатдегидрогеназы и ее изоферментов.

По сравнению с другими сезоанми года весенние периоды активность лактатдегидрогеназы и ее изоферментов ниже, особенно у изоферментов - ЛДГ1; ЛДГ2 и ЛДГ3 (табл. 61). Из анализа таблицы видно, что общая активность ЛДГ сперматозоидов и плазмы у свежеразбавленных в опытной среде значительно выше, по сравнению с контрольным вариантом. Активность ЛДГ сперматозоидов в опыте составляет 9,02 мкМ против 7,30 мкМ пировиноградной кислоты в контроле, а плазмы 2,34 мкМ против 0,94 мкМ. Разница между опытом и контролем статистически достоверна и составляет для сперматозоидов 23,5% (P<0,02) и плазмы 148,9% (P<0,01).

После замораживания-оттаивания активность лактатдегидрогеназы сперматозоидов в среда ГЦЖДУМ еще больше превосходит активность лактатдегидрогеназы сперматозоидов по сравнению с контрольной группой

Таблица 61- Изменение активности изоферментов ЛДГ сперматозоидов хряков при замораживании в среде

ГХЦЖК с добавлением (ГХЦЖКУ) n=6

Сперма	Показатель	Активность изоферментов ЛДГ в мкМ пировиноградной кислоты
ЛДГ1	ЛДГ2	ЛДГ3	ЛДГ4	ЛДГ5
После разбавления	Контроль*	0,563	0,180	0,623	2,291	2,976
опыт	069,	0,264	0,804	2,709	3,543
D+md	0,127±0,020	0,084±0,014	0,181±0,037	0,418±0,113	5,567±0,095
%	+22	+47	+29	+18	+19
Р	<0,01	<0,01	<0,01	<0,05	<0,01
После эквилибрации	Контроль*	0,361	0,163	0,456	1,888	2,569
опыт	0,386	0,152	0,448	2,109	2,610
D+md	0,025±0,045	-0,011± 0,012	-0,008±0,010	0,221±0,080	0,041±0,064
%	+7	-7	-1,7	+13	+2
Р	>0,01	>0,1	>0,1	>0,05	>0,1
После замораживания - оттаивания	Контроль*	0,263	0,102	0,306	1,569	1,473
опыт	0,286	0,161	0,380	1,999	2,197
D+md	0,023±0,005	0,059±0,010	0,074± 0,020	0,430±0,170	0,724±0,220
%	+9	+58	+24	+27	+49
Р	<0,05	<0,05	<0,02	0,05	<0,02
*- контроль среда ГХЦЖК: **- D+md – разница между опытом и контролем

Так, активность лактатдегидрогеназы в контроле 3,88 мкМ против 5,12 мкМ в опыте, т. е. выше на 32%. Поученные незначительные разницы между группами по активности лактатдегидрогеназы в плазме спермы после замораживания и после эквилибрации были не достоверными.

Исследование изоферментов лактатдегидрогеназы показывает, что разбавление спермы средой ГЦЖДУМ хотя и увеличивает активность изоферментов в 1-2 мк Молях пировиноградной кислоты, но не влияет на их процентное соотношение, наблюдаемое в среде ГХЦЖК.

Процентное соотношение активности изоферментов ЛДГ1 - ЛДГ5 в среде с унитиолом и мочевиной не изменяется и после замораживания-оттаивания сперматозоидов. В то время как в контрольном варианте (среда ГХЦЖК) после замораживания-оттаивания активность ЛДГ1 достоверно снижается.

Соотношение изоферментов лактатдегидрогеназы в плазме после эквилибрации и замораживания достоверно не изменяется.

Поученные данные, в которой активность изоферментов лактатдегидрогеназы выражена в мкМ пировиноградной кислоты, показывают, что при разбавлении спермы средой с унитиолом и мочевиной (ГЦЖДУМ) наблюдается значительное увеличение активности изоферментов сперматозоидов по сравнению с их активностью в среде ГХЦЖК (контроль). Эти увеличение составили - ЛДГ1 на 56,1%; ЛДГ2 - 43,6; ЛДГ4 - 20,7 и ЛДГ5 на 21,8%. Наблюдаемое увеличение ЛДГ3 31,2% из-за большого разброса статистически не оправдано. Эквилибрация и замораживание-оттаивание в среде ГЦЖДУМ как и в контрольном варианте вызывает снижение активности изоферментов и сперматозоидах.

Разница между опытом и контролем для ЛДГ1 достигает до 177%, для ЛДГ2 - 96,8%, ЛДГ4 - 27,4% и ЛДГ5 - 44,7%. Достоверной разницы активности между опытом и контролем не обнаруживается только для изофермента ЛДГ3.

В плазме как и в сперматозоидах при разбавлении спермы средой ГЦЖДУМ происходит увеличение активности всех изоферментов. Однако после замораживания-оттаивания активность изоферментов в опытной среде выше чем в среде ГХЦЖК.

Таким образом можно отметить, что в среде с унитиолом (0,028%) и мочевиной (0,30) - среда ГЦЖДУМ, наряду с повышением общей активности всех изоферментов и их устойчивости в клетках к повреждающему действию охлаждения и замораживания-оттаивания наблюдается лучшее сохранение в сперматозоидах активности изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ2, связанных с дыханием и сосредоточенных в митохондриях.