Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 25 )

Показатели	Варианты опыта
ГХЦЖК (контроль)	ГХЦЖК + дитиотре-итол (опыт)	Разница ±	В %
Подвижность, баллов	3,0±0,02	3,1±0,01	+ 0,1	3,4
Скорость движения, мкМ/с	95,8±8,05	96,2±7,64	+ 0,4	0.4
Абсолютный показатель живучести, ч	2,5±0,01	3,4±0,02	+ 0,9	36,0
Время редукции метиленовой сини, мин	16,7±0,45	14,5±2,03	- 2,2	-15,2
Сохранность SН-групп, %	62,2±5,13	70,4±6,52	+ 8,2	13,2
Число поврежденных акросом, %	31,8±3,04	23,7±1,86	- 8,1	-34,2
Активность общих дегидролгеназ, мин	54,4±6,06	48,7±4,63	- 5,7	-11,2
Активность цитохромоксидазы, мин	6,8±0,16	14,4±0,09	+ 7,6	211,7

Обнаружено также, что при добавлении дитиотреитола достаточно на высоком уровне сохраняются и внутриклеточных сульфгидрильных групп (70,4%). С дитиотреитолом активность общих дегидролгеназ особо не изменются, в то же время активность цитохромоксидазы увеличивается более чем в 2 раза.

Таким образом, добавленние дитиотреитола в среду ГХЦЖК положительно влияют на сохранения функциональной полноценности спермы хряков, следовательно. реагента можно использовать при разработке новой среды для криоконсервации эякулятов в качестве одного из криопротекторов.

3.3.4 Исследования совместного действия мочевины и унитиола на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков

Учитывая, что предедующих исследованиях у оттаянных сперматозоидов наибольшее увеличение подвижности было получено при введение в среду мочевины, а увеличение абсолютного показателя живучести - под воздействием унитиола, принято решение по изучению совместного влияния этих веществ на половые гаметы хряков.

Эксперименты проведены в двух вариантах: первый - на эякулятах разбавленных средой с унитиолом и мочевиной в отношении 1:1 и второй - на сперматозоидах отделенных от плазмы с полной заменой ее средой с унитиолом и мочевиной (ГХЦЖКУМ). Результаты опытов представлены в таблице 52.

Как следует из этой таблицы, все концентрации мочевины в сочетании с унитиолом дают достоверное повышение активности и абсолютный показатель живучести сперматозоидов. Однако, наиболее высокие результаты по времени переживания сперматозоидов при температуре +37° С после замораживания-оттаивания наблюдается при концентрациях мочевины 0,30%. Отделение плазмы благоприятно сказывается на активности и времени переживания сперматозоидов после оттаивания. Процент подвижных клеток также выше в сперме, замороженной после удаления плазмы и замены ее разбавителем, чем в разбавленной 1:1. Так, при сочетании унитиола в концентрации 0,014% и мочевины 0,30% в сперме, замороженной без отделения плазмы, количество перенесших замораживание сперматозоидов составляет 29% (2,9 балла) против 20% (2,0 балла) в контроле без мочевины и унитиола; ВП сперматозоидов увеличивается от 1,7 часа в контроле до 2,3 часа в опыте или на 35%.

При замораживании в этой же среде сперматозоидов, отделенных от плазмы, процент подвижных клеток достигает 44%, т. е. более чем в два раза превышает подвижность сперматозоидов в контрольной среде (ГХЦЖК) с плазмой.

Абсолютный показатель живучести клеток при этом увеличивается до 5,06 часа против 1,7 часа в контроле, что составляет 197,6%. При сравнении с контрольным вариантом, где сперматозоиды также отделены от плазмы, увеличение абсолютного показателя живучести составляет 156%.

При сочетании концентраций мочевины: 0,15; 0,30; 0,45% с 0,028% унитиола результаты опытов с разбавленной спермой достоверно не отличается от результатов при сочетании 0,014% унитиола с вышеназванными концентрациями мочевины. Однако в опытах со сперматозоидами, отделенными от плазмы (с заменой ее на среду), при концентрациях 0,028% унитиола и 0,30% мочевины, время переживания клеток выше чем в среде с концентрацией унитиола 0,014% и мочевины 0,30% и составляет 6 часов, что более чем в 3,5 раза превышает абсолютный показатель живучести контрольных сперматозоидов, не отделенных от плазмы, и на 87% выше, чем в контроле с отделенной плазмой. Активность сперматозоидов после оттаивания при этом составляет 4,8 балла (48%) против 2,0 балла (20%) в первом контроле и 2,6 балла (26%) - во втором (табл. 53).

Если учитывать абсолютный показатель живучести сперматозоидов по сохранению подвижности 5% клеток, то видно, что в данном случае концентрация мочевины 0,30% в сочетании с 0,028% унитиола дает наилучший эффект увеличение абсолютного показателя живучести равный 3,6 часа, что выше времени переживания, учитываемого по полному прекращению подвижности в контрольных вариантах.

Изучено влияние совместного введение унитиола и мочевины в среду ГЦХЖК на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков (табл.54). По сравнению с контролем при совместном ведении реагентов абсолютный показатель живучести увеличиваются на 36,0%, сохранности сульфгидрильных групп на 13,2 %, число поврежденных акросом уменшаются на 34,2% и активность цитохромоксидазы повышаются на 111,7% (рис 9).

Рисунок 9- Влияние совместного введение унитиола и мочевины в среду ГЦХЖК на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков

Таблица 52 Совместное влияение унитиола и мочевины в среде ГЦХЖК при замораживании спермы хряка на активность и абсолютный показатель живучести сперматозоидов после оттаивания

Вещество	Сперма разбавленная 1:1	Замена плазмы средой
Унитиол в %	Мочеви-на в %	Активность	Абсолютный показатель живучести	Активность	Абсолютный показатель живучести
в баллах	А0-Ак D±md	Р	в часах	D±md	%	Р	в баллах	А0-Ак D±md	Р	в часах	D±md	%	Р
0 контроль	0 контроль	2,0	-	-	1,7	-	100		2,6			3,2	-	100
0,014	0,15	2,8	0,8±0,4	0,1	1,9	0,2±0,1	111	>0,1	4,0	1,4±0,7	>0,1	5,2	2,0±0,3	158	<0,01
0,30	2,9	0,9±0,2	0,05	2,3	0,6±0,2	1,5	<0,05	4,4	1,8±0,6	<0,05	5,1	1,9±0,3	155	<0,01
0,45	2,5	0,5±0,3	0,1	2,1	0,4±0,2	124	>0,1	4,0	1,4±0,6	>0,05	4,8	1,6±0,4	150	<0,01
0,028	0,15	2,9	0,9±0,3	0,05	2,2	0,5±0,1	129	>0,01	4,6	2,0±0,7	<0,05	5,8	2,6±0,3	181	<0,01
0,30	2,8	0,8±0,3	0,05	2,3	0,6±0,2	135	<0,05	4,8	2,2±0,6	<0,01	6,0	2,8±0,9	187	<0,05
0,45	2,6	0,6±0,3	0,1	2,2	0,5±0,2	127	>0,05	3,6	1,0±0,3	<0,05	5,4	2,2±0,8	164	>0,05

Таблица 53- Абсолютный показатель живучести сперматозоидов (по сохранению 5% подвижности) в среде с унитиолом и мочевиной без плазмы после замораживания –оттаивания

Концентрация унитиола (%)	Концентрация мочевины (%)	Абсолютный показатель живучести, в часах	Р	Абсолютный показтель живучести (%)
М	D±md
0 (контроль)	0	1,7	-	-	100
0,014	0,15	3,4	1,7±0,22	<0,01	200
0,30	3,1	1,4±0,40	<0,05	182
0,45	3,0	1,3±0,23	<0,01	176
0,028	0,15	3,5	1,8±0,39	<0,01	206
0,30	3,6	1,9±0,21	<0,01	211
0,45	3,2	1,5±0,29	<0,01	188

Таблица 54- Влияние совместного введение унитиола и мочевины в среду ГЦХЖК на функциональную полноценность заморожено-оттаянной спермы хряков