Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 29 )

3.3.9 Изучение влияние унитиола и дитиотреитола на функциональное состояние заморожено-оттаянной спермы хряков

Предующие исследовании показали, что для стабилизации функциональной поноценности сохраняемой вне организма спермы хряков, наиболее эффективно влияют унитиол и дитиотреитол.

Эти тиоловые соедиенеия в широком диапозоне концентраций увеличивает подвижность и абсолютный показатель живучести сперматозоидов при кратковременном хранении, стабилизируют скорость движения и продлевает оплодотворяющей способности гамет хряков. Учитывая эти положительные стороны унитиола и дитиотреитола изучены их влияния на функциональное состояние заморожено-оттаянной спермы хряков. Полученые данные представлены в таблице 62.

Как видно из таблицы 62 лучшие результаты по всем качественным показателям спермы хряков и оплодотворяемость свиноматок были получены при введении в состав среды унитиола и дитиотреитола.

Таблица 62- Влияние унитиола и дитиотреитола в среде ГХЦЖКМ на функциональное состояние заморожено-оттаянной сперматозоидов хряков

Показатели	Варианты экспериментов (среда замораживания)
ГХЦЖКМ - контроль	ГХЦЖКМ+ унитиол	ГХЦЖКМ+ дитиотреитол
Подвижность, баллов	2,8±0,24	3,5±0,18	3,2±0,38
Скорость движения, мкМ/с	97,3±6,95	96,2±7,14	95,1±8,04
Абсолютный показатель живучести, ч	2,7±0,25	3,8±0,29	3,6±0,21
Время редукции метиленовой сини, мин	18,7±1,14	14,6±1,06	15,8±1,07
Сохранность SН-групп, %	63,2±4,62	72,9±5,01	69,6±4,25
Число поврежденных акросом, %	31,6±3,52	20,5±4,28	14,3±2,55
Активность общих дегидролгеназ, мин	52,4±4,35	46,2±5,76	48,9±6,29
Активность цитохромоксидазы, мин	5,6±0,61	18,9±0,48	13,4±0,62
Активность ЛДГ, мкМ пирувата на 1 млрд гамет	7,6±0,34	7,5±0,43	8,8±0,54
Оплодотворяющая способность, %	10,5±0,84	37,3±2,12	41,8±2,82
Сохранность поросят до 2-х месячного возраста, %	86,5±7,43	87,1±6,82	86,8±7,63

При этом абсолютный показатель живучести заморожено-оттаянных сперматозоидов, по сравнению с контролем увеличиваются на 33,3 – 40,7%, число поврежденных акросом уменшаются на – 11,1 – 17,3%, сохранность SН-групп увеличиваются на 6,4-9,7%, увеличиваются сохранности оплодотворяющая способности сперматозоидов хряков на 26,8-31,3%. Эти тиоловые соедиения не влияют на сохранности поросят до 2-х месячного возраста.

Таким образом установлено, что унитиол и дитиотреитол положительно влияют на функциональное состояние заморожено-оттаянной сперматозоидов хряков, следовательно их целесообразно включить в состав среды для замораживания спермы хряков.

3.3.10 Оплодотворяющая способность спермы хряков разбавленной новой средой ГЦДУМЖ

Результаты проведенных исследований по влиянию унитиола и мочевины на устойчивость сперматозоидов хряка к повреждающему действию низких температур позволили разработать среду для криоконсервации спермы хряков.

Новая среда, под условным названием глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоло-мочевиновая-желточная (ГЦДУМЖ), имеет следующий состав, г:

1. Глюкоза медицинская по ГОСТу 6038-51 (С6Н12О6 · Н2О), относительная молекулярная масса 198,7 - 50,0 г.

2. Натрия цитрат трехзамещенный по ГОСТу 3161-57 (Nа3Н6Н5О7 · Н2О), относительная молекулярная масса 357,16 - 2,8 г.

3. Калия цитрат двухзамещенный по ГОСТу 9190-59 (С6Н6О7К2), относительная молекулярная масса 388,644 - 0,6 г.

4. Хелатон ГОСТ 10552-63 (С10Н14О8 Nа2 · 2Н2О), относительная молекулярная масса 372,24 - 1,2 г.

5. Унитиол (2,3-димеркаптопропансульфонат натрия) по ТУШЗ 44-65 (СН2(SН)СН(SН)СН2SО3Nа · Н2О) относительная молекулярная масса 210,278 - 0,18 г.

6. Дитиотреитол (1,4димеркапто-2,3-диоксибутан) по ТУШЗ 45-65 –- 0,7 г.

7. Желток куриных яиц – 80 мл

8. Глицерин - 45 мл

9. Мочевина – 3,0 г

10. Вода дистиллированная – 1000 мл.

Условное название среды - ГЦДУМЖ.

Используемая в среде концентрации унитиола и дитиотреитола оказывают положительное влияния на оплодотворяемость, многоплодие свиноматок и качество потомства. Относительно влияния мочевины на эти показатели в литературе данных нет. Поэтому исследовали влияние среды ГЦДУМЖ на оплодотворяемость, многоплодие свиноматок и качество потомства при осеменении свежеразбавленной спермой.

Выявление свиноматок в охоте проводили один раз в сутки утром. Первое осеменение проводили после выявления рефлекса неподвижности, второе - через 24 часа свежеполученную сперму делили пополам, одну часть разбавляли средой ГЦДУМЖ в отношении 1:1, вторую - контрольной средой. В первой серии опытов контролем служила сперма, разбавленная молочной, а во второй – Трис-натрий ЭДТА средами.

От осеменения 14 свиноматок свежеполученной спермой, разбавленной средой ГЦДУМЖ, была получена высокая оплодотворяемость /85,7%/ (табл. 63). Многоплодие опоросившихся свиноматок составило 10,2 поросенка. Живая масса поросят при рождении и в месячном возрасте была одинаковой по сравнению с животными контрольой группы. В контрольной группе (разбавление молочными разбавителями) было получено 9,8 поросенка на свиноматку (P<0,01), а оплодотворяемость свиноматок на 7,1% ниже, чем в опытной группе. Учитывая известные недостатки молочного разбавителя, в следующей серии опытов проведено осеменение свиноматок двух групп-аналогов свежеполученной спермой, разбавленной средой ГЦЖДУМ и средой ГХЦС-8, широко применяемой в производственной практике искусственного осеменения свиней.

Превосходство среды ГЦДУМЖ по оплодотворяемости свиноматок составило 14,3% плодовитости 1,4% (рис. 13). Суммарные данные по всем опытам представлены в таблице 33. В среднем по всем опытам использование среды ГЦДУМЖ повысило оплодотворяемость свиноматок на 7,1% и 14,3% в сравнении со средами молочной и ГХЦС-8, а многоплодие - на 1,0 и 0,6 поросенка соответственно P<0,001. Увеличение многоплодности при исползовании спермы, разбавленной средой ГЦДУМЖ, вероятно, связано с действием дитиотреитола, так как в опытах предыдущих лет при разбавлении средой ГХЦЖКУ (среда без дитиотреитола) этого эффекта не наблюдали.

Проверяли также оплодотворяющей способности сперматозоидов, разбавленной средой ГЦДУМЖ и сохраненной в течение 3-х суток при температуре +5 С. Получили 13 опоросов при оплодотворяемости свиноматок 81,2%, многоплодие - 9,6 поросенка. На основании полученных данных считаем возможным и целесообразным использовать среду ГЦДУМЖ для криоконсервации спермы хряков, а также на пунктах искусственного осеменения свиней для осеменения свиноматок свежеразбавленной и храненной спермой.

Разработанная новая среда для криоконсервации спермы хряков, по сравнению с существующими аналогами имеет следующие основные примущества (рис. 11):

- введенные в состав разбавителя унитиол и дитиотреитол защищают от окисления SН-группы тиоловых ферментов (особенно группы дегидрогеназ), обеспечивающих обмен веществ сперматозоидов, в результате чего активность этих ферментов сохраняется и продолжительность жизни сперматозоидов увеличивается;

- повышают сохранности акросом сперматозоидов и тем самым споспобствуют улучшение оплодотворяющей способности заморожено-оттаянной сперматозоидов:

- унитиол и дитиотреитол способствуют сохранения структурных белков криоконсервированных сперматозоидов;

- унитиол и дитиотреитол стабилизируют процессы окислительного фосфорилирования после замораживания и оттаивания;

Рисунок 11 - Основные преимущества новой среды ГЦДУМЖ

Таблица 63- Результаты осеменения свиноматок свежеразбавленной спермой, ГЦДУМЖ

Разбавлены в среде	Число свиноматок, гол	% опороса	Число поросят на 1 свиноматку
осеменен-ных	перегуляв-ших	опоросив-шихся	живых	мертвых
Молочный	14	4	10	71,4	9,2±0,2	0,8
ГХЦС-8	14	3	11	78,6	9,6±0,4	0,7
ГЦДУМЖ	16	3	13	81,2	9,6±0,2	0,7
Трис-натрий ЭДТА	14	4	10	71,4	9,1±0,2	0,9

Рисунок 12 - Результаты осеменения свиноматок с новым разбавителем ГЦДУМЖ

Рисунок 13 - Результаты осеменеия свиноматок с различными разбавителями

3.3.11 Последовательность биотехнологических этапов при использования нового разбавителя спермы хряков - ГЦДУМЖ

Качество спермы хряков, ее способность к длительному хранению, а следовательно, оплодотворяемость и многоплодие свиноматок зависит не только от биологических особенностей спермы, но и от технологии ее получения. Наряду со снижением результатов биотехнологических работ при искусственном осеменении нарушения этапов или не выдержка установленных требований приводят к снижению воспроизводительных способностей хряков - к травмам, отказ делать садку на чучело и к импотенции.