Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 13 )

В контрольном опыте было устоновлено, что инкубация тетразолия с цистеином в течение 3 часов не приводит к появлению окраски.

Таблица 8-Влияние цистеина дегидрогеназную активность отмытых сперматозоидов

Концентрация цистеина (м)	Срок хранения спермы (час)
0	1	3	6	9	12
Активность дегидрогеназ (мин)
Контроль 6,7∙10-4 6,7∙10-3 3,3∙10-2 8,3∙10-2	221 91 41 37 47	226 122 48 35 59	282 159 52 42 62	336 228 57 42 79	349 239 70 50 85	353 247 77 53 88

Следовательно, резкое увеличение активности дегидрогеназ в сперме под влиянием цистеина происходит, по – видимому, в основном за счет активации дегидрогеназ плазмы спермы.

В следующем серии опытов было изучено влияние цистеина на содержание

SН–групп в половых клетках хряков. Найдено, что цистеин вызывает некоторое увеличение числа титруемых SН – групп в сперматозоидах. В то время как в контроле через 3, 9, и 24 часа инкубации было найдено – 10,5, 10,7 и 11,2 мкМ сульфгидрильных групп на 10 млрд. А сперматозоидах со цистеином найдено 10,6, 18,8 и 17,6 мкМ SН – групп соответственно. Это дает предполагать, что цистеин обладает способностью проникать через оболочку половых клеток хряков.

β-меркаптоэтанол – тиоловое соединение предохраняющий липиды от свободнорадикального окисления и тем самым способствуют сохранности сульфгидрильных групп клеток. Влияние β-меркаптоэтанола на сперматозоиды хряков представлены в таблице 9.

Таблица 9- Влияние β-меркаптоэтанол на абсолютный показатель живучести и дегидрогеназную активность сперматозоидов при температуре +20С

Концентрация β-меркапто-этанола ( М)	Срок хранения (час)	Абсолютный показатель живучести сперматозоидов
0	3	6	9	12	24
Активность дегидрогеназ (мин)	ед.	%
Продожение таблицы 9.
Контроль (без реагента)	54	67	67	76	90	41	9,01	100,0
6,7· 10-6	53	81	88	112	109	29	0,92	118,6
6,7· 10-5	54	80	91	117	106	24	10,21	122,3
6,7· 10-4	52	76	82	94	101	21	8,96	114,9
6,7· 10-3	18	20	38	37	42	18	2,11	92,1
6,7· 10-2	16	14	31	26	22	15	1,07	52,3
3,3· 10-2	9	12	21	21	11	11	0,59	32,5
5 · 10-2	7	6	12	14	7	3	0,37	19,4
3,3· 10-2	6	6	9	8	6	3	0,28	7,8
1,7· 10-2	5	5	9	8	6	3	0,12	4,4

β-меркаптоэтанол аналогично предыдущим реагентам в низких концентрациях увеличивают абсолютный показатель живучести половых клеток и их дегидрогеназную активность.

Дитиотреитол (1,4-димеркапто-2,3-диоксибутан) отличается высокой реактивной способностью SН-групп и могут предохранять липиды от свободнорадикального окисления, генетический аппарат клетки – от радиационного повреждения, а также стабилизировать окислительные ферменты и механизмы синтеза АТФ. Действие дитиотреитола представлены в таблице 10.

Таблица 10- Влияние дитиотреитола на абсолютный показатель живучести (АПЖ) и дегидрогеназную активность сперматозоидов при температуре +20С

Концентрация дитиотреитола, ( М)	Срок хранения (час)	АПЖ
0	3	6	9	12	24
Активность дегидрогеназ (мин)	ед.	%
Контроль (без реагента)	54	67	67	76	90	41	9,01	100,0
6,7· 10-6	52	72	87	94	97	96	10,92	107,2
6,7· 10-5	52	76	88	92	87	84	10,21	186,7
6,7· 10-4	49	71	88	82	84	81	8,96	192,8
6,7· 10-3	38	65	65	68	52	50	2,11	125,7
6,7· 10-2	27	34	48	57	23	20	1,07	78,4
3,3· 10-2	24	21	31	34	17	12	0,59	41,9
5 · 10-2	15	16	18	24	11	9	0,37	32,6
3,3· 10-2	13	9	12	12	9	9	0,28	24,2
1,7· 10-2	12	8	9	8	5	5	0,12	9,9

Лучшие результаты действия дитиотреитола на сперму хряков получены в концентрациях 6,7· 10-5 -6,7· 10-4. При добавлении к сперме эти концентрации абсолютный показатель живучести сперматозоидов повышаются на 86,7 – 92,8% ( в отдельных образцах спермы до 2 раза).

По-видимому дитиотреитол способствует сохранности сульфгидрильных групп сперматозоидов, предохраняют их липиды от свободнорадикального окисления, стабилизирует окислительные ферменты и механизмы синтеза АТФ половых клеток хряков.

Унитиол (2,3-димеркаптопропан-сульфонат натрия), (СН2 (SН) СН(SН) СН2SО3Nа · Н2О) - соединение широко употребляется в медицине в качестве антидота при отравлениях тяжелыми металлами человека. Лечение унитиолом основано на его способности вступать в реакцию с тяжелыми металлами с образованием малотоксичных стабильных комплексов. По данным свободные SН-группы унитиола прочно связываются с ионами тяжелых металлов, освобождая SН-группы белков, в результате чего функциональная активность последних восстанавливается.

Полученные результаты действие унитиола на подвижность, абсолютный показатель живучести и дегирогеназную активность цельную сперму хряков приведены в таблице 11.

Из данной таблицы 11 видно, что в широком диапазоне концентра­ций (от 6,7 · 10-6 до 6,7 · 10-3 М) унитиол значительно увеличивает абсолютный показатель живучести сперматозоидов хряков.

Нами обнаружено, что максимальное увеличение абсолютного показателя живучести сперматозоидов хряков получено при добавлении унитиола в концентрации 6,7 · 10-4 М. В этом слу­чае переживаемость сперматозоидов увеличилась на 172,9% по сравнению с контролем. Такое увеличение может иметь практическое значение при разработке технологии кратковременного и долговременного хранении спермы производителей.

В соответствии с инструкцией по искусственному осемене­нию свиней для осеменения допускается сперма, содержащая не менее 60% поступательно-подвижных сперматозоидов. При добавлении к сперме оптимальной концентрации (6,7 · 10-4 М) унитиола 60% сперматозоидов сохраняют поступательное движение более 18,5 часов, тогда как в контро­ле - только до 5 часов хранении. Таким образом, время, в течение которого неразбавленная сперма хряков сохраняет пригод­ность для осеменения, увеличивается в 3,48 раза.

Таблица 11- Влияние унитиола на абсолютный показатель живучести (АПЖ) и дегидрогеназную активность сперматозоидов при температуре +20С

Концентрация унитиола, ( М)	Срок хранения (час)	АПЖ
0	6	12	24	48	72
Активность дегидрогеназ (мин)	ед.	%
Контроль (без реагента)	64	90	97	104	88	72	10,48	100,0
6,7· 10-6	66	89	84	80	114	119	11,46	109,2
6,7· 10-5	41	77	73	72	73	81	17,01	162,3
6,7· 10-4	39	58	55	53	53	61	28,97	272,9
Продожение таблицы 11.
1,7· 10-3	16	38	39	39	50	53	19	182,8
6,7· 10-3	7	11	18	25	34	39	14	126,7
1,7· 10-2	5	5	6	6	14	18	13,23	64,1
3,3 · 10-2	5	5	6	6	11	13	6,75	15,4

Активность дегидрогеназ под действием унитиола повышается (таблица 11), за исключением концентрации 6,7 · 10-6 М. Специальный опыт показал, что унитиол в концентрации 1,3 · 10- 2 М и выше вступает в реакцию с хлоридом тетразолия и вызывает появление окраски в отсутствии дегидрогеназ. Влияние тиоловых соединений на абсолютный показатель живучести сперматозоидов хряков представлены на рис. 1.