Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 6 )

Несмотря на высокие криозащитные свойства, глицерин при концентрации в среде 5 и более % оказывает отрицательное действие на оплодотворяющую способность сперматозоидов хряка [82] еще до замораживания.

Установлено, что степень негативного влияния глицерина на сперму хряка зависит от его концентрации, времени и температуры экспозиции и связана, главным образом, с изменением осмотического давления при охлаждении. В исследованиях I. Wilmut и С. Polge [86] при инкубации спермы в среде с 10% глицерина при температуре 20° С в течение 0,5 и 6 часов оплодотворяющая способность ее составляла 73 и 36%, а при инкубации спермы в течение 6 часов в этой же среде при температуре +5°С оплодотворяющая способность составила 71%. Аналогичные результаты были получены и Г. Гайворонским [87]. Он считает, что при медленном насыщении разбавленной спермы глицерином чувствительность сперматозоидов к нему значительно снижается. Эти данные указывают на необходимость дальнейших исследований в направлении совершенствования технологических приемов замораживания спермы и поиска новых криозащитных веществ или их сочетаний качественно превосходящих глицерин. Перспективным направлением в создании новых криопротекторов является оксиэтилирование соединений спиртового ряда.

1.1.7 Поиски возможностей неспецифического повышение криоустойчивости клеток различными химическими раздражителями

Одним из возможных путей подхода к практическому решению проблемы криоконсервации клеток, в частности сперматозоидов хряков, является изыскание способов увеличения устойчивости сперматозоидов к повреждающему действию низких температур.

Исследования ряда авторов школы И. Соколовской [88] показана возможность неспецифического повышения устойчивости клеток воздействием раздражителей самой разной природы в подпороговых дозах. Одним из проявления такого неспецифического повышения устойчивости клеток является увеличение времени их переживания (УВП). [89] показала, что увеличение времени переживания изолированных мышечных тканей можно получить воздействием подпороговых концентраций самых разных химических агентов (соли, наркотики, сахара, ферментативные яды). При этом комбинация двух повреждающих агентов, из которых один взят в слабой (подпороговой) дозе, приводит не к суммированию их вредного действия, а к ослаблению. В этом плане особый интерес представляют данные [90] по влиянию химических агентов на сперматозоиды хряка.

[90] изучала влияние различных химических агентов (наркотиков, мочевины, ингибиторов обмена и др.) на переживаемость сперматозоидов хряка и отметила увеличение времени переживания при +5° С под влиянием большинства из испытанных агентов. Наибольшее увеличение переживаемости получено под воздействием 0,04% хлоралгидрата и мочевины в концентрации 0,3-0,75% и 0,04% хлоралгидрата.

Хорошо защищает мочевина и от последствий искусственного охлаждения организма животных до 20...10°С. Введение крысам 100 мг мочевины на 100 г массы перед охлаждением животных снижало их смертность после понижения температуры тела до 10° С на 20%.

Мочевина в низких концентрациях обладает способностью увеличивать устойчивость клеток во всех состояниях, для которых характерно увеличение перекисного окисления, изменение свойств и функций биомембран и усилении протеолиза при гипотермии, ожоговом шоке и др.

Однако, в исследованиях и [91] действие мочевины в высоких и низких концентрациях на перекисное окисление липидов носит противоположный характер. Добавление мочевины к гомогенатам мозга и печени в концентрации от 5×10-3 М до 0,5 М вызывает нарастающее снижение накопления молонового диальдегида в гомогенатах. Дальнейшее увеличение мочевины, до денатурирующих концентраций, вызывает нарастание продуктов перекисного окисления липидов.

Наряду с веществами вызывающими, в субтоксических концентрациях, повышение неспецифической устойчивости клеток, были выявлены вещества, обладающие способностью вызывать неспецифическое повышение резистентности клеток в концентрациях на несколько порядков ниже их субтоксических концентраций. К числу таких веществ относятся некоторые производные бензимидазола [92], препараты женшеня и элеутерококка колючего [93], которые [92] названы адаптогенами.

установлено, что под влиянием бензимидазола и его производных возрастает устойчивость клеток животных к повреждению, в частности возрастает устойчивость портняжной мышцы лягушки к повреждающему действию температуры. При этом бензимидазол не влияет на включение меченого лейцина в портняжную мышцу при комнатной температуре - усиливает включение данной аминокислоты в период, когда мышца подвергалась температурному повреждению. Дибазол препятствует снижению холестерина в надпочечниках кроликов при шоке вызванном и гипо - и гипероксией - если при шоке содержание холестерина снижается в два и более раза чем в контроле, то после предварительного введения дибазола - на 20%.

В частности производное бензимидазола 2-бензил-бензимидазол (дибазол) в концентрации 10-11 г/мл повышал абсолютный показатель живучести сперматозоидов быка, при хранении их при температуре 0°С. В то же время при физиологической температуре +38° С и данной концентрации дибазола 10-11 г/мл переживаемость сперматозоидов в опыте не отличалась от переживаемости в контроле. Хотя в подпороговой концентрации 10-3 г/мл дибазол увеличивал время переживания сперматозоидов. Достоверное увеличение времени переживания сперматозоидов хряка наблюдалось и при их хранении в среде с 0,05% дибазола при температуре +5°С [93]. Следовательно, дибазол обладает способностью повышать устойчивость клеток к воздействию повреждающих факторов, в данном случае низких температур. Показано, что дибазол может участвовать в повышении терморезистентности функции мышечных клеток путем повышения структурной устойчивости миофибриллярных белков. При этом установлено, что дибазол уменьшает окисление свободных сульфгидрильных групп. SH-группы входят в активные центры многих ферментов и коферментов и играют важную роль в метаболических процессах клеток. Образование дисульфидных связей (-S-S-) в результате окисления SH-групп или реакции дитиол-дисульфидного обмена -2SH = -S-S - является одной из причин гибели сперматозоидов при их хранении in vitro [34]) или при замораживании, когда происходит необратимая потеря функциональной активности клеток в результате денутарационных изменений белков.

Липидные перекисные соединения - это продукты свободнорадикального окисления (СРО), образующиеся в клеточных структурах при окислении ненасыщенных жирных кислот. Как известно, свободнорадикальное окисление протекает во всех тканях живых организмов [63]. Поскольку "свободнорадикальное окисление непрерывно протекает в норме во всех тканях живых организмов, и свободнорадикальные процессы при их низкой интенсивности являются одним из типов нормальных метаболических процессов" низкие концентрации гидроперикисей необходимы для метаболизма, а ускорение СРО приводит к патологии.

Внимание к вопросу свободнорадикального окисления и биологической значимости перекисного окисления липидов мембран не случайно. Установлено, что накопление продуктов перекисного окисления липидов в мембранах меняет структуру мембран, их проницаемость, устойчивость липид-белковых комплексов и в результате происходит нарушение функциональной деятельности мембранных структур клетки [35].

Имеется ряд причин вызывающих активизацию СРО, накопление в клетках и тканях живых организмов продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и снижение антирадикальной активности липидов. Одной из этих причин по мнению и [94] является холодовое воздействие на клетки и их замораживание-оттаивание Так, в работах и др. [54]). При охлаждении и замораживании спермы баранов, быков и хряков наблюдается накопление токсических продуктов в результате ПОЛ [34] и изменение активности антиоксидантных ферментов.

1.1.8 Теоретические основы использование антиоксидантов для криозащиты сперматозоидов

[95] проводя экзогенное воздействие на сперматозоиды продуктами перекисного окисления липидов путем их внесения в инкубационную среду, наблюдал повреждения сперматозоидов аналогичные изменениям после температурного шока. В результате таких изменений происходит нарушение белково-липидных комплексов мембран и гомеостаза клеток. Известно, что кроме тиоловых соединений содержащих свободные SH-группы антиоксидантными свойствами обладают производные фенола. Так, введение в состав среды для криоконсервации сперматозоидов: креозола, бутилокситолуола, бутилоксианизола позволило уменьшить интенсивность ПОЛ и соответственно, повысить устойчивость сперматозоидов к температурному шоку и замораживанию-оттаиванию. Как показали результаты исследований [96], введение в состав среды антиоксидантов, приводит к достоверному снижению количества акросомных повреждений сперматозоидов после замораживания-оттаивания и повышает их выживаемость и переживаемость. При этом введении в инкубационную среду сочетания антиоксидантов оказывается более эффективным для сперматозоидов, чем введение одного антиоксиданта.

Окислительные процессы в липидах мембран и их интенсивность поддерживается различными системами клетки на определенном уровне. Действие системы природных антиоксидантов тесно связано с другими системами, регулирующими скорость перекисного окисления липидов.

Установлено, что при направленном повышении количества природных антиоксидантов в липидах мембран изменяется их фосфолипидный состав, при этом наблюдается увеличение скорости перикисного окисления липидов. и др., [97] установили, что повышение антиокислительной активности липидов за счет накопления в них синтетических антиоксидантов также приводит к увеличению окисляемости липидов. Следовательно, увеличение окисляемости липидов в ответ на повышение антиокислительной активности липидов является неспецифической реакцией. Антиоксиданты, попадая в липиды, тормозят их окисление и поэтому в липидах накапливаются те фракции, которые окисляются в первую очередь.

Среди синтетических антиоксидантов типа фенолов и аминов наиболее близки к природным антиоксидантам производные гидрохинонов, вторичных аминов и диаминов, 3-оксипиридинов. Введение таких биологически активных веществ приводит к устойчивому повышению антиокислительной активности липидов, которое вызвано не только поступлением в липиды синтетических антиоксидантов, но и накоплением в них природных антиоксидантов. Такие синтетические антиоксиданты перспективны для эффективной защиты сперматозоидов при их охлаждении и замораживании от развития в них процессов перекисного окисления и, соответственно, повреждения их мембранных структур.