Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 14 )

Следовательно, увеличение активности дегидрогеназ в присутствии высоких концентраций унитиола трудно оце­нить количественно и полученные результаты могут быть не достоверными.

3.1.3 Исследование изменение окислительного фосфорилирования в сперматозоидах под действием тиоловых соединений

Нами было изучено влияние восстановленного глутатиона, цистеина, β-меркаптоэтанола, дитиотреитола и унитиола на окислительное фосфорилирование в свежеполученном эякуляте хряков. Установлено, что такие тиоловые реагенты как восстановленный глутатион, цистеин и β-меркаптоэтанол на процесс протекания окислительного фосфорилирования в сперматозоидах положительно не влияют. Влияние унитиола и дитиотреитола на окислительное фосфорилирование в сперматозоидах хряков приведены в таблице 12 и рисунке 1.

Таблица 12- Влияние унитиола и дитиотреитола на окислительное фосфорилирование в сперматозоидах хряков

Тиоловые реагенты	Концен-трация в молях	Срок хран-ения, час	Актив- ность сперма-тозоидов, %	Количество поглащенного кислорода и фосфора в мкг/атомах на 108 клеток	Р/О	Измен-ение Р/О в процен-тах к контролю
Р неорг.	О2
Контроль	-	1	82	1,32	0,88	1,50	100,0
Унитиол	1,7·10-4	1	86	143	0,82	1,74	+11,6
1,7·10-2	1	64	1,02	0,59	1,72	+11,4
Дитиотреитол	6,7· 10-5	1	83	1,38	0,80	1,72	+11,6
6,7· 10-2	1	54	0,94	0,56	1,67	+11,1
Продожение таблицы 12.
Контроль	-	12	51	1,28	0,83	1,54	100,0
Унитиол	6,7·10-4	12	81	2,84	1,43	1,98	+1,28
1,7·10-2	12	42	1,14	0,82	1,39	-0,90
Дитиотреитол	6,7· 10-5	12	75	2,59	1,36	1,90	+1,23
6,7· 10-2	12	36	0,96	0,71	1,35	-0,87
Контроль	-	24	5	0,34	0,47	0,7	100,0
Унитиол	6,7·10-4	24	49	1,62	0,91	1,67	+2,38
1,7·10-2	24	12	0,28	0,29	0,22	-0,31
Дитиотреитол	6,7· 10-5	12	31	1,47	0,82	1,79	+2,55
6,7· 10-2	12	3	0,17	0,22	0,67	-0,95

После 12 часов инкубации спермы с унитиолом в концентрации 6,7·10-4 М окислительное фосфорилирование увеличивается на 28,0% по сравнению с контролем, а через 12 часов отношение Р/О остается почти на уровне свежеполученной спермы.

Унитиол в высокой концентрации (1,7·10-2 М) в впервые часы инкубации снижает фосфорилирование и дыхание сперматозоидов незначительно, а дальнейшем начинается процессы ингибирование окислительное фосфорилирование гамет животных.

Анологичные процессы происходит и дитиотреитолом. В этом случае изменение фосфора к кислороду при концентрации 6,7· 10-5 М повышается на 11,6%, а при 6,7· 10-5 этот показатель равна 2,55%.

Таким образом, тиоловые соединения в впервые часы инкубации снижает фосфорилирование и дыхание сперматозоидов незначительно, а дальнейшем начинается процессы ингибирование окислительное фосфорилирование гамет животных.

3.1.4 Исследование изменении цитохромоксидазной активности спермы под действием унитиола и дитиотреитола

Опыты по изучению активности цитохромоксидазы определяли в цельной сперме хряков, сохрянявшейся при комнатной температуре (+18..20 0С. Действие этих реагентов на активность цитохромоксидазы представлено в таблице 13.

Таблица 13- Влияние унитиола на цитохромоксидазную активность спермы хряков

Концентрация реагентов (М)	Срок хранения спермы (час)
0	1	3	6	9	12	24
Активность цитохромоксидаз (мин)
Контроль	48	48	50	51	51	53	55
Продожение таблицы 13.
6,7∙10-6 унитиол 6,7∙10-5 унитиол 6,7∙10-4 унитиол 3,3∙10-3 унитиол 1,7∙10-2 унитиол	48 48 77 190 -	50 51 83 24 -	50 53 96 277 -	60 62 116 290 -	71 72 133 - -	72 75 161 - -	74 76 174 - -
6,7·10-6 дитиотреитол	46	51	52	68	79	86	91
6,7· 10-5 дитиотреитол	47	53	56	76	83	98	115
6,7· 10-4 дитиотреитол	81	94	112	184	226	-	-
6,7· 10-3 дитиотреитол	203	241	-	-	-	-	-
6,7· 10-2 дитиотреитол	-	-	-	-	-	-	-

Анализ таблицы 13 показывает, что добавление унитиола в низких концентрациях (6·10-6 – 6,7·10-5 М) приводит к снижению активности фермента цитохромоксидазы после 6 часовой инкубации. При добавлении реагента в концентрации 6,7·10-4 М происходит быстрое ингибирование активности фермента цитохромоксидазы.

Рисунок 1- Влияние тиоловых соединений на абсолютный показатель живучести сперматозоидов хряков

Сильное торможение активности цитохромоксидазы наблюдается при использовании унитиола в концентрации 3,3·10-3 М, в этот случае после 9 часов инкубации происходит полное торможение. При использовании унитиола в концентрации 1,7·10-2 М потеря активности фермента спермы хряков происходит сразу после добавления. Практически схожие результаты получены с дитиотреитолом. Реагент в концентрации 6,7· 10-6 М практически не влияют на активность фермента, Повышение концентрации дитиотреитола приводит к торможению активности

Добавление тиоловых соединений к свежеполученной сперме хряков в низких концентрациях (6,7·10-6 - 6,7·10-4 М) приводит к снижению активности цитохромоксидазы, практически с первых часов инкубации. Особенно заметное становится после 6 часовой инкубации спермы с реагентом. Процесс ингибирование активности фермента идет параллельно со сроком инкубации спермы с реагентом.

Следовательно, цитохромоксидазная активность спермы хряков подавляются с тиоловыми реагентами, но степень торможение зависит от концентрации и продолжительности срока инкубации спермы с реагентами.

3.1.5 Влияние востановленного глутатиона и унитиола на скорость движения сперматозоидов хряков

В разделе 3.1.2 диссертации отмечено, что востановленный глютатион в низких концентрациях (2·10-7 М) стимулирует абсолютный показатель живучести сперматозоидов и несколько повышает активность общих дегидрогеназ спермы хряков. Высокие концентрации (2·10-5 М) этого реагента резко сокращает переживаемость и ингибирует активность дегидрогеназ.

В свзи с этим изучено влияние этих концентрации востановленного глутатиона на скорость движения сперматозоидов.

Данные, приведенные в таблице 14, показывают, что в контроле скорость движения сперматозоидов несколько снижается в первые три часа инкубации, а затем поддерживается на постоянном уровне. При добавлении к сперме востановленного глутатиона в концентрации 2·10-7 М скорость движения сперматозоидов в течение всего периода инкубации 60 м/сек, а в контроле 50 м/сек. Это свидетельствует о стимуляции движения сперматозоидов под влиянием низкой концентрации востановленного глутатиона. При зтой концентрации скорость движения сперматозоидов в течение 12 часов остается почти без изменений (58-60 м/сек).

Увеличение скорости движения сперматозоидов в начальный период наблюдается также после добавления востановленного глутатиона в концентрации 2·10-5 М. Однако с увеличением срока инкубации спермы с реагентом скорость движения сперматозоидов начинает резко падать, а через 9 часов инкубации движение прекращается совсем.

Следующим реагентом для изучение скорости движения сперматозоидов из тиоловых соединений взято – унитиол.

Таблица 14- Влияние востановленного глутатиона на скорость движения сперматозоидов (мкм/с)

Срок инкубации спермы (час)	Контроль	Концентрация востановленного глутатиона (М)
2∙10-7	2∙10-5
Количество спермиев	Скорость м/сек	Количество спермиев	Скорость м/сек	Количество спермиев	Скорость м/сек
0 1 3 6 9 12	174 208 188 189 161 160	50 46 41 51 46 46	227 246 231 181 208 183	60* 63* 53* 57* 61* 56*	168 51 46 18 - -	59* 25** 20** 21** - -

Выше было отмечено, что унитиол в концентрации 6,7·10-4 М увеличивает подвижность и переживаемость сперматозоидов, а в концентрации 1,7·10-2 М, наоборот, подавляют их.