Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 8 )

Используя быстрое замораживание спермы путем гранулирования на сухом льду B. G. Crabo и S. Einarsson [17], S. Graham et al., [117]; V. G. Pursel и L. A. Johnson [27]; L. Richter и А. Liedike [104]. На программной установке [118] добился успешных результатов с получением опоросов после осеменения свиней замороженно-оттаянной спермой.

с сотрудниками [44] на программной морозильной установке был испытан ряд режимов охлаждения спермы от 0° С до -180° С со средней скоростью от 4,5 до 60 °С в мин. Наилучшие результаты по подвижности сперматозоидов после оттаивания (t 38...40 °C) были получены при замораживании спермы с максимальной скоростью. При средней скорости падения температуры 60 град/мин подвижность восстанавливали 55...60% сперматозоидов против 25...35% при скорости охлаждения 4,5 град/мин. Аналогичные результаты получили в своих исследованиях болгарские ученые и [119]. Необходимо отметить, что приведенные средние скорости снижения температуры не являются прямолинейными функциями. Изучение замораживания показало, что форма кривой падения температуры приближается к параболической. Соответственно и скорость снижения температуры идет с нарастанием. В исследованиях и сотрудников [44] в лучшем варианте скорости падения температуры составляли за 1-ю мин. 26°С/мин, за 2-ю мин - 75° С/мин и за 3-ю - 125° С/мин.

Исследования G. Waide [120] подтверждают данные о преимуществе быстрого замораживания перед медленным. В его опытах сперма замороженная в алюминиевых пакетах быстрым охлаждением в парах жидкого азота в течение 3-х мин. от +5 до -100° С имела после оттаивания большую подвижность 47,6% ,чем сперма после медленного замораживания от +5° С до -20° С со скоростью 1 с/мин и от -20° С до -70° С, со скоростью 3° С/мин 19,2%. В то же время имеется сообщение F. Monji [121], в котором отмечается, что сперма хряков лучше сохраняется при медленном способе замораживания. Однако в данном сообщении не приводятся сведения об оплодотворяющей способности сперматозоидов, которые подтвердили бы преимущество медленного режима замораживания.

При замораживании в гранулах режим охлаждения в определенной степени можно регулировать путем изменения их объема. S. Salamon [80] замораживал сперму на сухом льду в виде гранул объемом 0,08; 0,16; 0,32; 0,64 мл. После оттаивания лучшую активность сперматозоидов наблюдал у гранул с минимальным объемом. Однако D. Schmidt [122], после осеменения свиноматок спермой замороженной в виде гранул объемом 0,1 и 1,0 мл получил одинаковую оплодотворяемость.

В других опытах V. G.Pursel и L. A. Johnson [27] выживаемость сперматозоидов не зависела от объема гранул в пределах 0,1...0,5 мл, но возрастала переживаемость с увеличением объема, а при замораживании спермы в виде гранул объемом 0,1; 2 и 5 мл после оттаивания подвижность сперматозоидов составляла 38, 34 и 29% соответственно.

Имеются сообщения Р. Westendrf et al., [123] и J. G.Aalbers et al., [124] и др. о замораживании спермы в больших объемах по 5-6 мл в виде "больших соломин", и [119], в алюминиевых тубах и других емкостях по 5...8 мл, а также [10] и [41] полиэтиленовых пакетах по 20...25 мл. Однако этот вопрос пока остается нерешенным, хотя имеет существенное значение в связи с необходимостью замораживать большие объемы эякулятов и более совершенной среды для замораживания и оттаивания.

1.1.9.2 Теоретические обоснование механизмов оттаивания криоконсервированной спермы хряков

Важную роль в сохранении функциональной полноценности сперматозоидов при их оттаивании играет режим оттаивания. По данным Л. Рэ [125] и Дж. Фаррант [126] при отогреве криоконсервированной спермы в температурной зоне от -150 до -51° С наблюдали рекристализационные процессы, по их мнению которые могут вызвать значительные морфологические и функциональные изменения клеток. В диапазоне температур от -80 до -150 °С скорость нагрева мало влияет на сохранность сперматозоидов. По данным и [127] наиболее интенсивно рекристализационные процессы в замороженной сперме протекают в интервале температур от -80 до -50 °С. В связи с этим при оттаивании замороженной спермы наибольшая скорость оттаивания должна поддерживаться именно в этой зоне.

Начиная с температуры -51 °С, в системе появляется жидкая фаза и вместе с ней создаются условия протекания осмотических процессов

По данным [36], по мере таяния концентрация жидкой части постоянно меняется до полного перехода твердой фазы в жидкую. Поэтому температурный интервал между -50 °С и 0 °С так же нужно проходить с возможно высокой скоростью.

При оттаивании спермы примерно до -20° С нагревание, независимо от скорости притока тепла, идет почти одинаково и очень быстро [128]. Затем наступает некоторая задержка подъема температуры, длительность которой обусловлена скоростью подвода тепла [129].

В отличие от спермы других сельскохозяйственных животных (быки, бараны, птицы) оттаивание спермы хряков осложняется необходимостью одномоментного разбавления больших объемов спермы.

Для оттаивания спермы ряд авторов применяли подогретые стеклянные колбы или так называемый "сухой" способ ([80] и [11]), а другие авторы использовали для оттаивания подогретые среды - или так называемый "мокрый" способ ([17]; [111]; [130]; [104]; [131] и [132]).

По некоторым данным М. Paquignon и др. [133] лучшие результаты получаются при оттаивании спермы в разбавителях при 50°С. Однако в сравнительных опытах I. Kozumplik [134] показал преимущество "сухого" способа перед "мокрым". При осеменении свиноматок спермой оттаянной "сухим" способом в тефлоновых сосудах подогретых до 44, 50 и 65° С с последующим разбавлением оттаянной спермы средой получил 70,6% опоросов, против 58,8% при осеменении свиней спермой оттаянной в подогретой среде.

Исходя из данных, что скорость отогрева спермы от -196° С до -80° С не оказывает существенного влияния на оплодотворяющую способность спермы. V. Pursel и L. Johnson [135] испытали двухступенчатый режим оттаивания. Перед перенесением в подогретую до 50° С среду для оттаивания гранулы замороженной спермы выдерживали в течение 3 мин. в контейнере из пенопласта. Такая выдержка гранул способствует поднятию их температуры от -196° С до -70° С, что ускоряет оттаивание в подогретой среде с 35 до 15 сек. В результате повышалась доля сперматозоидов с нормальной акросомой с 48% до 65%, а подвижность с 28 до 50%.

Для одновременного оттаивания большого объема замороженной спермы В. Кононов с соавторами [136] разработали устройство, позволяющее при оттаивании спермы сразу отделять жидкую, оттаянную сперму от еще твердой, не оттаянной фазы. Устройство представляет своеобразный термостат с водяным обогревом, при заданной температуре, обычно 42-43° С.

А. П., Зверева и [137] предлагают аналогичного действия прибор, но другой конструкции. Прибор в виде навитой в одной плоскости спирали из хромированной медной трубки, по которой подается подогретая вода. Опытным путем установлена оптимальная температура циркулирующей в оттаявателе воды. Наиболее высокие показатели по активности получены при температуре воды в оттаява° С. Размораживание спермы в объеме 55 мл протекает в течение 26 сек.

B. G.Crabo [138], D. Schuler et al., [139]; М. Ibrahim и L. Kovaсs [140]; J. G. Aalbers и др., [124] предлагают сперму, замороженную в пайетах, оттаивают в водяной бане при температуре 52° С в течение 52 сек. или по данным Р. Westendorf et al., [141] при 50° С до полного таяния.

При условии соблюдения всех других факторов, для успешного осеменения необходимо, чтобы общий объем разбавленной спермы был не менее 50 мл с содержанием в нем порядка 3 млрд. физиологически полноценных сперматозоидов. Из-за удаления семенной плазмы при концентрировании спермы хряков перед ее замораживанием возникает проблема достижения необходимого объема после оттаивания замороженной спермы. Эту проблему, как отметили выше, решают путем разбавления оттаянной спермы плазмой спермы хряков, снятым молоком или синтетической средой. Наиболее приемлемым для практики в технологическом и экономическом отношении является синтетическая среда. Поэтому к настоящему времени уже разработано несколько разных составов специальных сред для разбавления оттаянной спермы [47]. Однако проблема создания среды наиболее адекватной для разбавления замороженно-оттаянной спермы еще остается.

1.1.10 Теоретические основы роли низкомолекулярных тиоловых соединений спермы животных

1.1.10.1 Исследование функциональной роли сульфгидрильных групп в белковых молекулах

К настоящему времени установлена, что белковая молекула содержит разных функциональных групп. Среди функциональных групп белковых молекул выделяются высокой реакционной способностью и разнообразием своих химических реакций серосодержащие, в особенности сульфгидрильные (SН-) группы, необходимые для проявления биологической активности многих белков и поддержания их макромолекулярной структуры. Содержащаяся в белках сера принадлежит сульфгидрильной, или тиоэфирной группе метионина [142; 143; 144; 145; 146; 147; 148; 149; 150].

Ряд ферментов содержат кофакторы. К числу тиоловых кофакторов относятся глутатион, липоевая кислота, коэнзим А, простатической группой которых является 4-фосфопантетеин и эрготионеин. Роль SН-групп в этих соединениях во многих отношениях аналогична роли SН-групп цистеиновых остатков, выполняющих каталитические функции в активных центрах некоторых ферментов [151; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158].

По данным М. Диксона и Э. Уэбба [159] в настоящее время насчитывается свыше 110 ферментов, активность которых тормозится при блокировании содержащихся в них SН-групп. Среди них представители всех классов ферментов, катализирующих самые разнообразные превращения. Ряд исследователи подтвердили эти предположения своими экспериментами [160; 161; 162; 163; 164].

Исследователями K Bailey, S. Perry [165] было обнаружено, что взаимодействие сократительных белков –актина и миозина зависит от присутствия SH-групп в их молекулах. Работами , [166] и других [167; 168; 169] показано, что АТФ –азная активность миозина и способность его взаимодействовать с актином изменяется параллельно изменениям количества SH-групп в его молекуле.