Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 7 )

Ю. Лелекова и Ф. Романовский и др., [98] отмечают, что в последние годы повысился интерес к исследованиям по изучению влияния малых и сверхмалых количеств биологически активных веществ на неспецифическую резистентность клеток, тканей и организмов.

В литературных источниках отсутствуют работы посвященные поиску способов неспецифического повышения (в сочетании со специфическими) устойчивости сперматозоидов к повреждающему действию низких температур при их криоконсервации. Целенаправленные исследования в этом направлении могут стать одним из возможных путей в разработке и совершенствовании криоконсервации спермы животных.

Во второй половине ХХ века проведены ряд успешных экспериментов по криоконсервации спермы хряков. Среди них наиболее полными являеются исследовании и др. [72], [13], и др., [99], и др., [100], [10], С. Polge et. al., [82] и многие другие сообщают о проведении успешных экспериментов по криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных, в том числе и хряков.

К настоящему времени имеется целый ряд работ об успешных результатах по криоконсервации спермы хряков, Разработано и предложено для практического использования несколько методов криоконсервации спермы хряков, которые позволяют получать в среднем около 60% опоросов от свиноматок осемененных замороженно-оттаянной спермой. Эти методы различаются между собой составами сред для замораживания и оттаивания, способом замораживания, технологией обработки спермы

с соавторами [101], и [102]) предложены новый метод обработки спермы хряков пред замораживанием. Этот метод основаны на диализе цельной спермы, вместо разбавления спермы криопротекторами. На этой основе предложены два варианта криоконсервации спермы, отличающиеся высокой результативностью.

Технология криоконсервация спермы это процесс, состоящий из последовательных этапов, из которых можно выделить три, общие для всех методов:

1. Получение спермы и ее разбавление.

2. Охлаждение спермы и ее подготовка к замораживанию.

3. Замораживание спермы при низких температурах.

Соответственно и успех результатов криоконсервации зависит от того, насколько удачно и правильно подобраны состав среды и точно выполняются эти этапы.

1.1.9 Биологические особенности спермы хряков.

В начальных этапах по криоконсервации разбавление спермы средой для замораживания проводили сразу после ее получения (в течение 10...20 мин). Основанием для этого служило то, что плазма спермы активизирует обменные процессы сперматозоидов, сокращая продолжительность их функционирования [34]. Однако как показали данные и др., [44]; и [103], [13], С. Pursel et al., [27]) выдержка свежеполученной спермы в течение 1...2 часов перед разбавлением оказывает положительное влияние на сохранность акросом сперматозоидов и их устойчивость к охлаждению. Результаты осеменения свиноматок замороженно-оттаянной спермой хряков подтвердили необходимость такой выдержки. Высокая результативность осеменения наблюдалась именно в опытах, где сперма перед ее разбавлением выдерживалась в течение 1-2 часов.

По [13] положительное действие инкубации спермы перед разбавлением на последующую устойчивость сперматозоидов к охлаждению при замораживании обусловлено их взаимодействием с катионными белками плазмы спермы. Такие взаимодействия вызывают существенные изменения структуры мембранных липидов, что отражается на характере их фазового перехода при охлаждении. У свежеполученных сперматозоидов затвердевание липидов происходит кристаллически, в то время как у сперматозоидов подвергнутых инкубации затвердевание липидов протекает аморфно, что менее разрушительно для мембран гамет.

Подтверждением роли плазмы в повышении устойчивости спермы при ее инкубации служат результаты опытов, которые показывают, что с повышением степени разбавления спермы средой более чем 1:2, чувствительность сперматозоидов к холоду увеличивается.

В отличие от других видов сельскохозяйственных животных сперма хряков характеризуется большим объемом эякулята при более низкой концентрации сперматозоидов. Поэтому разбавление средой целого эякулята спермы приводит к значительному увеличению объема спермы, а замораживание больших объемов спермы делает метод криоконсервации технологически не выгодным для производственных условий. В связи с этим одновременно с разработкой методов криоконсервации целого эякулята спермы после ее разбавления усилия исследователей были направлены и на уменьшение объемов замороженной спермы путем ее концентрирования.

Еще в 1900 г. [1] показал возможность оплодотворения яйцеклеток при осеменении самок одними сперматозоидами, взвешенными в физиологическом растворе. Проведенные исследования L. Richter и А. Liedicke [104], W. M. Maxwell и S. Salamon [105] и др. определение влияния удаления плазмы спермы путем центрифугирования на качество сперматозоидов после замораживания-оттаивания показали, что удаление плазмы спермы и замена ее средой для криоконсервации способствует повышению выживаемости и абсолютный показатель живучести сперматозоидов.

Как установил [1], при эякуляции сначала выделяется секрет уретральных желез, вытекающий из мочеполового канала еще до начала полового акта, затем к нему присоединяется секрет куперовых желез, потом следует выделение сперматозоидов вместе с секретами придатка семенника и предстательной железы и, наконец, выделение секрета пузырьковидных желез [35]. Исходя из этого L. Richter и А. Liedicke [104], W. M. Maxwell и S. Salamon [105] получали, и использовали для криоконсервации пустую, богатую сперматозоидами фракцию эякулята.

Работы ряда авторов показали, что в отличие от целого эякулята, густую фракцию рекомендуется разбавлять средой в течение 10-20 мин. после получения. По данным и др. [106]) длительная выдержка густой фракции спермы оказывает отрицательное влияние на устойчивость сперматозоидов к охлаждению при криоконсервации. Видимо это связано со снижением в густой фракции спермы веществ, обладающих антиокислительными свойствами в результате отсутствия секретов придаточных желез.

Известно, семенная жидкость (плазма) - секрет придаточных желез, содержит в своем составе в больших количествах фосфолипиды [107]), лимонную кислоту [108]) и эрготионина [109]). Эти вещества обладают способностью защищать мембраны сперматозоидов от развития в них процессов свободнорадикального окисления и накопления в клетках продуктов перекисного окисления, которые снижают устойчивость сперматозоидов к охлаждению.

Некоторые исследователи рекомендуют использовать концентрированную часть эякулята. В связи с использованием приема концентрирования спермы при ее замораживании возникает вопрос не оказывает ли негативное влияние центрифугирование спермы, а также удаление плазмы после центрифугирования или при получении густой фракции спермы на оплодотворяющую способность сперматозоидов.

По данным H. D.Moore et al., [110] отделение секрета пузырьковидных желез положительно сказывается на оплодотворяющую способность сперматозоидов после замораживания. S. Einarsson с соавторами [111] не обнаружили достоверной разницы в оплодотворении свиней при использовании для разбавления замороженной спермы плазмы спермы или обрата молока. В то же время С. Viring и А. Einarsson [112] установлено, что сперматозоиды в большем количестве достигают верхних участков яйцеводов от маточного рога если они водились вместе с плазмой спермы.

Сравнительное испытание замораживания целых эякулятов и густой фракции спермы Polge Levelock [113] показало, что сперматозоиды из густой фракции, после оттаивания, обладают большей выживаемостью, переживаемостью и оплодотворяющей способностью.

Касаясь влияния центрифугирования спермы на качественные показатели сперматозоидов, в особенности на их оплодотворяющую способность после замораживания-оттаивания предполагается, что центрифугирование спермы в пределах до 20 мин. при более 800 об/мин. повреждающего действия на сперматозоиды не оказывает ([99]; [80]; [10]). Правда имеется мнение и о возможном отрицательном действии центрифугирования на криоустойчивость сперматозоидов [13]. Прямых исследований по этому вопросу в литературе не имеется.

Исследование двух режимов охлаждения спермы от 30 до 0°С: быстрый 3 град/мин и медленный 0,125 град/мин, показало, что и мембранные липиды сохраняются лучше при медленном охлаждении [67]. Увеличение времени выдержки спермы повышает устойчивость сперматозоидов и к быстрому охлаждению до 0°С [27] и замораживанию-оттаиванию [114]. Такое повышение устойчивости сперматозоидов к охлаждению до 0°С зависит от исходной температуры инкубации спермы. Устойчивость сперматозоидов наибольшая при начальной температуре инкубации 30...34° С и уменьшается со снижения температуры инкубации до 0° С. По данным и др., [115] чем ниже температура инкубации, тем меньше способность клеток, в данном случае сперматозоидов, к адаптации.

Исследование [13] показали длительная выдержка разбавленной спермы хряков сначала 2 часа при +15° С, а затем 3 часа при +5° С повышает выживаемость сперматозоидов и сохранность их акросом.

Благоприятное влияние длительной выдержки разбавленной спермы при температуре +5° С на выживаемость и качество сперматозоидов после замораживания было замечено еще в 50-х годах С. Полджем и Л. Роусоном [82] при разработке метода криоконсервации спермы быков.

С целью уменьшения активизирующего действия плазмы на обменные процессы сперматозоидов и снижения уровня окислительных процессов, в результате которых образуются токсические для сперматозоидов продукты, некоторые авторы предложили проводить выдержку семени перед замораживанием в условиях анаэробиоза [44]. С этой целью сперму выдерживали в атмосфере водорода. Эти данные представляют интерес не только с практической стороны (повышается оплодотворяющая способность замороженно-оттаянной спермы), но и с теоретической, поэтому требуют продолжения дальнейшего исследования.

1.1.9.1 Исследование механизмов устойчивости сперматозоидов хряков к замораживанию

Механизмы устойчивости сперматозоидов к действию низких температур до начала кристаллизации и кристаллообразовании различны, хотя развитие этих повреждений является продолжением проявления структурных изменений мембран на начальных этапах охлаждения. После сообщения W. Baier [15] о получении поросят от свиней осемененных спермой замороженной при медленном охлаждении попытки других исследователей получить потомство от спермы замороженной при медленном охлаждении не увенчались успехом [116]. При медленном замораживании спермы, сперматозоиды после оттаивания утрачивали оплодотворяющую способность, хотя и сохраняли достаточно высокую подвижность.