Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 22 )

Разбавление спермы хряков глюкозо-хелато-цитратно-желточно-калиевой (ГХЦЖК) средой вызывает изменения в изоферментном спектре лактатдегидрогеназы. В сперматозоидах и плазме увеличивается активность изоэнзима ЛДГ5 за счет чего в процентном отношении активность ЛДГ4 снижает­ся. Наблюдается возрастание и отношения изоэнзима ЛДГ5, состоящего только из субъединиц М к изоэнзиму ЛДГ1 состоящему из субъединиц Н, а также некоторая активация суммарной доли М субъединиц к сумме Н субъединиц в клетках. Охлаждение разбавленной спермы до +5° С в период эквилибрации вызывает выход фермента из половых клеток в плазму, в результате чего активность фермента в сперматозоидах падает при одновременном возрастании ее в плазме эякулята (табл.42). Как видно из таблицы 40, общая активность ЛДГ сперматозоидов после эквилибрации в среде ГХЦЖК оставляет: 5,13 мкМ пировиноградной кислоты на 109 половых клеток или 58,0% от активности в свежее разбавленной сперме хряков. Активность в плазме эякулята фермента при этом увеличивается на 24% к исходному уровню. Еще больший выход фермента из сперматозоидов наблюдается после замораживания-оттаивания спермы хряков.

Таблица 40- Изменение общей активности лактатдегидрогеназы в сперме хряков при замораживании и оттаивании

Сперма	Актив-ность спер-матоз-оидов, %	Активность ЛДГ в мкМ пировиноградной кислоты
сперматозоиды	плазма
на 109 клеток	D±md	в %	на 109 клеток	D±md	в %
Свежеразбав-ленная	87,5	8,63	-	100	4,21	-	100
После эквилибрации (+5 0С)	63,7	5,09	3,58	58,0	5,03	0,88	119
После замораживания-оттаивания	18,4	2,16	6,49	23,0	4,64	0,47	102
D±md - разница между опытом и контролем

Количество фермента в сперматозоидах после замораживания-оттаивания в среде ГХЦЖК составляет всего 23,0% от исходного уровня свежеразбавленной спермы хряков. Активность фермента в плазме спермы после замораживания-оттаивания выше, чем в плазме свежеразбавленного эякулята (табл. 41). Однако эти активности фермента меньше чем после эквилибрации спермы хряков.

Полученные данные в таблице 42 свидетельствуют о том. что одновременно с выходом фермента из сперматозоидов, охлаждение и замораживание-оттаивание спермы вызывает и его инактивацию фермента половых клеток. При рассматри­вании процентного соотношения изоферментов до и после заморажи­вания сперматозоидов видно, что после эквнлибрации эякулята в среде ГХЦЖК с глицерином особых изменений в процентном распределении изоферментов не происходит.

После замораживания и оттаивания, за счет сильного снижения активности изоферментов (вплоть до полной инактивации отдельных изоферментов) происходит изменение их процентного соотношения в половых клетках хряков.

Так. в сперматозоидах, замороженных в среде ГХЦЖК, активность ЛДГ1 составляет 15% от суммарной активности всех изофер­ментов, ЛДГ2 – почти равно нулю, ЛДГ3 -8,5%, ЛДГ4 -30,1% и ЛДГ5 - 46,2%.

Таблица 41- Изменение активности изоферментов ЛДГ в сперме хряков после охлаждения и замораживания

в среде ГХЦЖК

Части эякулята	Активность изоферментов в мкМ пировиноградной кислоты
ЛДГ1	ЛДГ2	ЛДГ3	ЛДГ4	ЛДГ5
Сперматозоиды: свежеразбавленная	1,15±0,18	0,29±0,04	1,68±0,37	1,59±0,43	3,84±0,42
после эквилибрации	0,81±0,13	0,06±0,01	1,25±0,28	1,06±0,34	2,69±0,43
после замораживания- оттаивания	0,41±0,09	0,02	0,8±0,03	0,81±0,15	2,51±0,54
Плазма спермы свежеразбавленная	0,58±0,14	0,41±0,07	0,50±0,08	0,79±0,31	0,28±0,03
после эквилибрации	0,84±0,09	0,41±0,08	0,57±0,06	1,81±0,56	0,66±0,04
после замораживания- оттаивания	0,61±0,07	0,46±0,09	0,54±0,06	0,91±0,08	1,23±0,44

Таблица 42- Изменение активности изоферментов (ЛДГ) в сперматозоидах

хряков при замораживании-оттаивании в осенне-зимнем периоде

Сперма	Активность изоферментов ЛДГ в мкМ пировиноградной кислоты, на 109 клеток
общая	ЛДГ1	ЛДГ2	ЛДГ3	ЛДГ4	ЛДГ5
После разбавления	7,76±0,64 (100%)	0,25	0,12	0,42	2,17	4,34
После охлаждения до +5 0С (эквилибрации)	4,88±0,29 (66%)	0,12	0,06	0,35	1,48	2,86
После замораживания	3,89±0,31 (53%)	0,09	0,6	0,32	1,29	2,14

Процентное соотношение изоферментов в плазме эякулята после заморажива­ния-оттаивания также изменяется, увеличивается ЛДГ5 - 29,8% против 13,5% в свежеразбавленной сперме хряков. Однако эти изменения в соотношении изоферментов не влияют на общее соотношение М и Н субъединиц лактатдегирогеназы спермы. Имеется только тенденция на увеличение доли "анаэробных" (М) субьединиц спермы.

Таким образом наши исследования показали, что в сперматозоидах и плазме нативной спермы хряков наибольшая доля количества лактатдегидрогеназы приходится на ЛДГ4 и составляет соответственно 38,7% и 32,3%. Разбавление спермы средой ГХЦЖК вызывает изменения в изоферментном спектре лактатдегидрогеназы. В половых клетках и плазме эякулята увеличивается активность изоэнзима ЛДГ5. Установлены выход фермента из половых клеток. Количество фермента в сперматозоидах после замораживания-оттаивания составило всего лишь 23,0% от исходного уровня свежеразбавленной спермы. Одновременно с выходом фермента из сперматозоидов, охлаждение и замораживание-оттаивание эякулята вызывает и его инактивацию. Эта инактивация связана с окисление сульфгидрильных групп молекулы лактатдегидрогеназы.

3.3 Исследование влияния тиоловых соединений на заморожено-оттаянной сперме хряков

Эффективность криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных в значительной степени зависит от состава используемых сред для разбавления. Назначение сред состоит в том, чтобы обеспечить надежную защиту от неблагоприятных факторов внешней среды, усугубляемых при консервации действием низких и сверхнизких температур спермы производителей.

Работами ряда авторов ([10], [20], [35], [43], [46]) показано, что большую опасность для сперматозоидов представляют осмотические явления. В результате быстрого охлаждения или оттаивания мембрана сперматозоидов повреждаются и нарушается осмотическое давления внутри половых клеток.

Это явление получило название «температурный шок» спермы. [36] установил, что в основе температурного шока лежит повреждение мембран сперматозоидов, вызываемое уравновешиванием концентрационного градиента, который возникает на границе раздела клетка-среда при резком изменении температуры. Так как клетка окружены мембраной обладающей избирательной проницаемостью, уравновешивание происходит в результате входа или выхода воды из клетки и других жизненно важных веществ. Слишком быстрый поток воды через мембрану может привести к ее повреждению.

Таким образом, можно заключить, что отличительной особенностью действия низких температур на сперматозоиды является его многофакторность. Необходимо замораживание сперматозоидов рассматривать как сложный биотехнологический процесс, слагающийся из ряда этапов. На каждом технологическом этапе действует много взаимосвязанных условий. Результат зависит от специфики объекта, скорости замораживания и применяемого криопротектора для клеток.

Знание повреждающих факторов, действующих на разных этапах низкотемпературной консервации, дает возможность разработать соответствующую программу замораживания и применять криозащитные соединения, позволяющие до минимума уменьшить действия этих факторов на клетки.

Основными компонентами сред, защищающими сперматозоидов от холодового удара, кристаллизации, гипотонии и гипертонии при криоконсервации являются неэлектролиты (сахара), желток куриного яйца, различные криопротекторы и буферные системы.

Предедующие наши исследования показали, что тиоловые соединения способствуют увеличение жизненного цикла половых клеток и продолжительное время и сохранности оплодотворяющей способности сперматозоидов хряков и поэтому нами решено изучить возможности применения в качестве криопротекторов спермы хряков

3.3.1 Влияние цистеамина, цистеина и меркаптоэтанола на функциональные показатели криоконсервированных сперматозоидов

В начальном этапе изучения пригодности в качестве криопротекторов из тиоловых соединений использованы – цистеамин, цистеин и меркаптоэтанол.

Установлены, что среди использованных тиоловых соедиенеий цистеамин оказался токсичным для сперматозоидов хряков. При добавлении цистеамина в среду ГХЦЖК сперматозоиды теряли подвижность, резко сокращались абсолютный показатель живучести гамет и поэтому реагент в дальнейшем в экспериментах не был использован (табл. 43).

Анализ таблицы 43 показывают, что при добавлении цистеина происходит определенные изменения в функциональных полноценностях заморожено-оттаянной спермы хряков.