Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 16 )

Таким образом внесение в сперму хряков востановленного глутатиона и унитиола, последный оказался более эффективным. Установлено, что внесение унитиола в сперму хряков увеличивает не только переживаемость спермы и сроки пригодности неразбавленной спермы хряков для осеменения свиноматок в течение 9-10 часов, но и обеспечивает высокую оплодотворяемость сперматозоидов и получение качественного потомства.

3.1.8 Изучение действие низкомолекулярных тиоловых соединений на отмытые от плазмы сперматозоидов хряков

На отмытые от плазмы сперматозоиды хряков унитиол свое положительное влияния на дегидрогеназную активность проявил в концентрации 6,7·10-3 М (табл. 18) т. е. в более низкой концентрации, чем при добавлении реагента к цельной сперме.

Таблица 18- Влияние унитиола на дегидрогеннальую активность отмытых сперматозоидов хряков

Концентрация унитиола (М)	Срок хранения спермы (час)
0	1	3	6	9	12
Активность дегидрогеназ (мин)
Контроль 6,7∙10-6 6,7∙10-5 6,7∙10-4 1,7∙10-3 6,7∙10-3 1,7∙10-2 3,3∙10-2	71 59 55 49 34 24 10 6	101 92 75 65 41 27 10 7	138 115 105 73 46 38 10 10	164 158 109 95 47 34 16 12	171 161 134 107 53 38 19 14	173 170 140 116 58 44 21 15

В концентрации 6,7·10-3 М унитиол увеличивает дегидрогеннальую активность отмытых сперматозоидов хряков от 37-41%. В опытах на отмытых и ресуспендированных сперматозоидах установлено, что в этом случае макси­мальное положительное влияние унитиола проявляется в 6,7 · 10-5 М, т. Е. в более низкой концентрации, чем в цель­ной сперме хряков-производителей (табл. 19). Концентрации реагента от 6,7∙10-6 до 6,7∙10-4 М увеличивает абсолютный показатель живучести на 33,1- 74,7%. Как показано в таблице 19. Наивысшее увеличение жизнеспособности (74,7%) получено при добавлении ресуспендированным половым клеткам хряков получено унитиола в концентрации 6,7∙10-5 М. Увеличение концентрации реагента свыше 1,7∙10-3 приводит к снижению жизнедеятельности половых клеток хряков.

Таблица 19- Влияние унитиола на подвижность и переживаемость отмытых от плазмы сперматозоидов хряков

Концентрация унитиола (М)	Срок хранения спермы (час)	АПЖ	Р
0	1	3	6	9	12	24	26	36
Активность сперматозоидов (баллы)	ед.	%
Контроль 6,7∙10-6 6,7∙10-5 6,7∙10-4 1,7∙10-3 6,7∙10-3 1,7∙10-2 3,3∙10-2	0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,70 0,60 0,50	0,62 0,67 0,72 0,72 0,70 0,62 0,48 0,27	0,40 0,52 0,60 0,55 0,48 0,40 0,17 0,07	0,28 0,37 0,45 0,45 0,30 0,20 - -	0,20 0,22 0,35 0,35 0,20 0,02 - -	0,10 0,15 0,28 0,25 0,12 - - -	0,05 0,05 0,07 0,07 - - - -	0,02 0,05 0,05 0,02 - - - -	- 0,05 0,05 - - - - -	4,86 6,47 8,49 7,61 4,30 2,91 1,17 0,72	100 133,1 174,7 156,6 88,5 59,9 24,1 4,8	0,001 0,001 0,001 0,05 0,001 0,001 0,001

Эти данные еще раз показывают большую роль плазмы спермы хряков при воздействии на них тиоловых соединений. Можно думать, что SН-группы добавленного к сперме унитиола защищают от окисления SН-группы тиоловых ферментов. В частности общую дегидрогеназу спермы. Этот фермент участвуют в обеспечении обмена веществ сперматозоидов, а это в свою очередь способствуют сохранению жизнеспособности сперматозоидов и увеличение продолжительность жизни половых клеток.

3.1.9 Разработка среды для кратковременного хранения спермы хряков

Известно, что неразбавленная сперма хряков при температуре + 18…20 0С сохраняет оплодотворяющую способность не более 6-8 часов. В исследованиях и др.[231] активность сперматозоидов неразбавленной спермы хряков с оценкой 6 баллов, сохраняется при комнатной температуре до 6 часов. При этом оплодотворяемость свиноматок, осемененных спермой хранившие в течение 10 ч снизилось 3 и более раза, а многоплодие свиноматок на 21%, по сравнению осеменения свиноматок свежеполученной спермой.

Современные методы для разбавления и хранения спермы животных содержат компоненты, являющиеся метаболическими субстратами (сахара), увеличивающие буферность спермы и замедляющие изменение рН в процессе ее хранения (цитраты и фосфаты), смягчающие проявление температурного шока (желтки куриных яиц) или предупреждающие разрушение сперматозоидов в процессе их замораживание (глицерин), действующие на микрофлоры спермы (антибиотики и сульфаниламидные препараты) и т. д.

Поскольку сперматозоиды неспособны восстанавливать свои структуры, разрущающиеся в процессе метаболизма, методы сохранения их жизнеспособности основаны на явлении анабиоза – обратимого неактивного состояния, при котором метаболизм клеток замедляется или временно прекращается. Наиболее часто состояние анабиоза достигается понижением температуры, закислением среды, созданием анаэробных условий и введением в состав сред метаболических ингибиторов.

Исследование роли сульфгидрильных групп в сперме хряков и установление положительного влияния унитиола на неразбавленную сперму дало нам основание для разработки новой среды, одними из компонентов которых являются дитиотреитол и унитиол.

Для составления среды, состоящий из семи компонентов, мы использовали статистические методы планирования экстремальных экспериментов и [24]. Из многих возможных путей поиска оптимальных условий был применен метод крутого восхождения по градиенту. Суть этого метода – шаговый принцип поиска оптимума при неполном знании процесса. Движение к оптимуму осуществляется путем постановки небольших серий опытов со спермой хряков, в каждом из которых одновременно варьируют по определенным правилам всеми факторами. После математической обработки результатов предыдущей серии выбрали условия проведения следующей.

Применение данного метода позволило оптимизировать соотношение компонентов в новой разработанной нами среде с включением дитиотреитола унитиола.

Новая среда, под условным названием глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловая (ГЦДУ), имеет следующий состав, г:

1.  Глюкоза медицинская по ГОСТу 6038-51 (С6Н12О6 · Н2О), относительная молекулярная масса 198,7 - 45,0 г.

2.  Натрия цитрат трехзамещенный по ГОСТу 3161-57 (Nа3Н6Н5О7 · Н2О), относительная молекулярная масса 357,16 - 4,15 г.

3.  Натрий двууглекислый по ГОСТу 4201-66 (NаНСО3), относительная молекулярная масса 84,01 - 0,75 г.

4.  Калия цитрат двухзамещенный по ГОСТу 9190-59 (С6Н6О7К2), относительная молекулярная масса 388,644 - 2,50 г.

5.  Дитиотреитол (1,4димеркапто-2,3-диоксибутан) по ТУШЗ 45-65–0,15 г.

6.  Унитиол (2,3-димеркаптопропансульфонат натрия) по ТУШЗ 44-65 (СН2(SН)СН(SН)СН2SО3Nа · Н2О) относительная молекулярная масса 210,278 - 0,27 г.

7.  «Спермосан-3» - 6,0 г.

8.  Вода дистиллированная – 1000 мл.

Исследованиями установлены, как видно из таблицы 20, что при хранении сперма хряков при температуре + 2 0С в новой. разработанной среде ГЦДУ в течении 4-5 суток сохраняются оплодотворяющую способность сперматозоидов хряков-производителей.

Таблица 20- Абсолютный показатель живучести сперматозоидов хряков в новой среде и средах аналогах

Среда	Активность сперматозоидов по суткам хранения спермы, баллов	АПЖ
0	2	4	6	8	усл. ед	%
ГХЦС-8	8,2	5,8	3,1	1,4	-	672,4	108,7
ГХЦ	8,2	5,6	3,0	1,2	-	618,1	100,0
ГЦДУ	8,2	6,8	6,2	3,1	0,7	886,7	143,4

По сравнению с существующими аналогами, новая разработанная среда способствует удлинение жизнеспособности сперматозоидов хряков. Разработанная новая среда увеличила абсолютный показатель живучести сперматозоидов хряков на 43,4% по сравнению со средой глюкозо-хелато-цитратным (ГХС) средой и на 34,7% со средой ГХЦС-8.

Проведенные эксперименты с новой средой ГЦДУ по изучено влияния выдержки в темноте перед разбавлением, при температуре +18 0С. Установлено, что в процессе дальнейшего хранения выдержка половых клеток хряков перед разбавлением со средой ГЦДУ в темноте, улучшает сохраность акросом сперматозоидов и их подвижности (табл.21и рис. 4).В качестве

контроля взята переживаемость сперматозоидов при ее разбавлении сразу после получения.

Таблица 21- Влияние выдержки спермы перед разбавлением средой ГЦДУ на ее переживаемость

Выдержка спермы перед разбавлением, мин	АПЖ, % к контроля	Выдержка спермы перед разбавлением, мин	АПЖ, % к контроля
0	100	80	98
20	127	100	86
40	144	120	81
60	118

Из таблицы 21 видно, что наивысший абсолютный показатель живучести сперматозоидов (144%) получена при выдержке спермы перед разбавлением средой ГЦДУ в течение 40 минут.