Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 20 )

Кроме того приведенные выше данные исследований показали, что изменение скорости дыхания спермы возможно вследствие разобщения дыхания и фосфорилирования в результате “холодового шока” например, при получении спермы. Это может вызвать накладку ошибки при отборе животных.

Добавление сукцината к сперме животных из I-ой группы приводит к увеличению (стимуляции) скорости дыхания сперматозоидов, что, как отмечали выше, указывает на повреждение их внешней мембраны или нарушение ее проницаемости. Следовательно стимуляция дыхания сперматозоидов при добавлении сукцината более чем 1,1 раза (Vц/Vэ>1,1) является показателем низкой криоустойчивости сперматозоидов.

Более лучше характеризует устойчивость спермы к замораживанию реакция дыхания сперматозоидов в ответ на добавление динитрофенола. Как видно из таблицы 35 стимуляция дыхания с динитрофенолом сперматозоидов второй группы привело к значительному повышению дыхания, чем у сперматозоидов первой группы. Это данные показывают, что сперматозоидов с хорошим сопряженным дыханием и фосфорилированием более устойчивы к замораживанию.

Подсчеты показали, что коэффициент корреляции между величиной стимуляции дыхания динитрофенолом и оплодотворяющей способностью спермы равен +0,71 (P<0,001). Из данных таблицы 35 следует, что для сохранения оплодотворяющей спесобности сперматозоидов после замораживания-оттаивания >50% необходимо отбирать для криоконсервации свежеполученную сперму со стимуляции дыхания - VДНФ/Vэ>3,0, при стимуляции дыхания сукцинатом калия менее 1,1 раза (Vсц/Vэ<1,1).

Поскольку падение температуры спермы до субнормального уровня - “холодовой шок” - оказывает повреждающее действие на сперматозоиды. В. Кононов [81], Ф. Осташко [36], В. Наук [45] предложили использовать тетст устойчивости спермы к холодовому шоку для определения пригодности отдельных эякулятов быков-производителей к замораживанию.

Учитывая эти предложения, нами проведены исследования возможности использования теста устойчивости спермы к холодовому шоку для отбора криоустойчивого эякулята хряков. С этой целью изучали наличие связи между показателями качества сперматозоидов после “холодового шока” и оплодотворяющей способностью сперматозоидов после замораживания-оттаивания (устойчивость к замораживанию).

Таблица 35- Показатели энергетического обмена и абсолютного показателя живучести сперматозоидов свежеполученных сперматозоидов хряка с различной оплодотворяющей способностью после замораживания

Груп-па	n	Оплодотво-ряющая способ-ность	Абсолютный показатель живучести сперматоз-оидов час	Скорость дыхания в нано АО2/мин на109 клеток	Vcц Vэ	VДНФ Vcц
Vэ	Vсц	VДНФ
I	24	26,6±3,82	12,1±0,8	167±11	179+15	373±21	1,1	2,2
II	12	80,3±5,41	14,2±0,9	91±8,8	91±8,2	373±23	1,0	4,2
P		<0,01	<0,01	<0,01	<0,01	<0,05	<0,05	<0,05

В экспериментах температурный шок сперматозоидов вызывали быстрым снижением температуры от +37°С до +2°С. Для этого 3 мл спермы выдерживали в ледяной ванне в течение 10 мин. Подвергнутую шоку сперму оценивали по активности, абсолютный показатель живучести, времени редукции метиленовой сини, сохранности акросом и стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом. Результаты опытов показали, что время переживания, стимуляция дыхания 2,4-динитрофенолом, а также время редукции метиленовой сини сперматозоидов, а также процент сохранности акросом после температурного шока имеют достоверную корреляцию с оплодотворяющей способностью сперматозоидов. Установлено, что наиболее высокую корреляцию при этом имеют сохранность акросом и величина стимуляции дыхания сперматозоидов хряков. Общие суммарные результаты изучения связи показателей спермы подвергнутой холодовому шоку с ее оплодотворяющей способностью после замораживания-оттаивания показали, что показатели спермы с оплодотворяющей способностью после замораживания <50% (средняя оплодотворяющая способность 32%) отличались от показателей спермы с оплодотворяющей способностью >50% (средняя оплодотворяющая способность 78%) по активности на +18%, времени переживания на +22%, стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом на +33% а по времени редукции метиленовой сини на -29% и по количеству поврежденных акросом на -21% (табл. 36). Существенные различия средних значений показателей шокированной спермы в группах животных с низкой и высокой оплодотворяющей способностью спермы после замораживания свидетельствует о возможности использования этих показателей для отбора криоустойчивости сперматозоидов хряков.

Таблица 36 - Связь между показателями подвергнутой температурному шоку спермы и ее оплодотворяющей способностью после замораживания-оттаивания

Показатели спермы, подвергнутой температурному шоку	Оплодотворяющая способность замороженно-оттаянной спермы, %	Коэффициент корреляции
меньше 50 (31,9+3,1)	больше 50 (77,4+5,8)
Активность, балл	2,5+0,06	3,2±0,89	+0,31х
Время переживания, час	4,1+ 0,84	5,2±1,07	+0,65х
Время редукции метиленовой сини, мин	21,7+1,97	16,1+3,24	-0,58х
Поврежденных акросом, %	36,3+2,65	15,6±5,75	-0,83х
Дыхание исходное, Vэнд	75,9+7,43	70,1±9,12	-
Дыхание с 2,4-ДНФ, Vднф	118,5+5,76	143,4±12,34	-
Стимуляция дыхания 2,4-ДНФ, Vднф/Vэнд	123,6+9,87	155,9±14,03	-
тх - досоверная связь

Таким образом, при отборе спермы для замораживания считаем целесообразным использовать показатель стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом и свежеполученной и подвергнутой температурному шоку спермой в сочетании с оценкой сохранности акросом половых клеток.

3.2.4 Влияния криоконсервации на сульфгидрильны (SH-) группы спермы хряков

Ряд исследователи A. Smith, C. Polge [6], E. Graham, B. Crabo [16], А. Варнавский, [23], В. Милованов и др. [44] считают, что потеря оплодотворяющей способности сперматозоидов хряков - это результат криогенных повреждений акросомного аппарата сперматозоидов при замораживании и оттаивании. В то же время И. Смирнов [5], A. Blackshfw, C. Salisbury [29], Е. Платов [7] считают, что она связана отсутствием оплодотворяемости при осеменении замороженной спермой связано с нарушением способности сперматозоидов к нормальному движению или с их малой выживаемостью в половых путях самки в результате повреждения структуры кинетического центра и энергетического аппарата (митохондрий) сперматозоидов под воздействием низких температур и высоких температур при оттаивания.

Поэтому при разработке метода криоконсервации спермы и поиске способов защиты сперматозоидов от повреждающего действия низких температур, очень важно знать особенности и характер наиболее типичных криогенных изменений в каждом отделе сперматозоида хряков

Сперматозоиды хряка, по сравнению с гаметами других сельскохозяйственных животных, обладают наименьшей устойчивостью к повреждающему действию низких теиператур. Поэтому, исследование природы их криогенных изменений представляется важным для поиска способов криозащиты и оценки половых клеток других видов животных. Сперматозоиды хряка, на наш взгляд, могут служить в некотором роде модельным объектом при совершенствовании методов криоконсервации, криозащиты и оценки функциональной полноценности эякулятов и у других видов сельскохозяйственных животных.

Исследованиями B. Luyet и E. Hodapp [3] было установлено, что сперматозоиды очень богаты сульфгидрильными группами. Эти группы присутствуют во многих ферментах и других белковых соединениях половых клеток, участвуют в обеспечении нормального функционирование жизненных процессов протекающих в сперматозоидах. нгельгардта и Г. Яровой [167] показали, что взаимодействие сократительных белков актина и миозина зависит от присутствия в их молекулах сульфгидрильных групп.

По данным А. Ленинджер [174] сульфгидрильные группы участвуют в реакциях сопряжения окислительного фосфорилирования, а Р. Озрина, М. Кондрашова, [191] считают, что определенную роль в этом играют проницаемости мембран митохондрий.

Таким образом следует предполагать, что одной из причин повреждения клеток при криоконсервации считается окисление сульфгидрильных групп с образованием дисульфидных (-S-S-) связей, что приводит к денатурации белков клеток.

После проведения работ по выяснению количественных показателей SН-групп в сперматозоидах и плазме спермы, изучение влияния тиоловых соединений на свежеполученную сперму хряков, на следующем этапе экспериментальных работ, нами изучены изменения этих показателей у половых клеток при охлаждении (температурного шока) и замораживании-оттаивании.

Определение количества общиx сульфгидрильных групп в свежеполученной сперме от 6 хряков показало наличие в 10 млрд сперматозоидах в среднем 10,2 мкМ SH-групп и в 100 мл плазмы 2,2 мкМ при вариабельности показателя по эякулятам в пределах 6,5-14,7 мкМ/109 половых клетках и 0,8-5,3 мкМ/100 мл плазме эякулята. По отдельным хрякам-производителям эти колебания выглядело следующим образом: колебания SH-группы от 9,4 до11,1 мкМ/109 половых клетках и от 1,9 до 2,9 мкМ/100 мл плазме эякулята. В гаметах подвергнутых температурному шоку наблюдалось снижение количественного содержания сульфгидрильных групп в среднем на 14,9%. Наблюдаемое снижение в плазме было не достоверно (табл.37 ).