Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 11 )

Время переживания (ВП) сперматозоидов определяли при постоянной температуре и выражали в часах. Все пробы опыта находились с колебаниями температуры в пределах не более 0,1°С. Время учитывали от начала опыта до полного прекращения активности сперматозоидов, или до сохранения 3-5% подвижных сперматозоидов. Разбавление спермы хряков проводили в соответствии ГОСТ 17637-72. Среда глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная для хранения спермы хряков.

Криоконсервацию спермы проводили по «Инструкции по технологии работы организаций по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных» [241].

Общее содержание сульфгидрильных групп в плазме спермы и отмытых дезинтегрированных сперматозоидах определяли методом амперометрического титрования [Kolthoff J. M., Harris W. E. [242], в модификации , , [245], и колориметрическим методом при помощи 5,5-дитиобис (2-нитро-бензойной кислоты) [, [150].

Сохранность акросом оценивали методом фазово-контрастной микроскопии. Скорость движения сперматозоидов определяли по методике и .

Для оценки целостности акросомы сперматозоидов свежеполученной спермы после хранения ее при плюсовых температурах, или на разных этапах обработки при криоконсервации и последующем оттаивании широко использовали микроскопию окрашенных препаратов спермы. Использовались карболэозином (Larsson К., Einarsson S., [129]) или метод фозово-контрастной микроскопии (Pursel V. G. et al., [27]; Е. Gracham et al., [16]; К. Larsson et al., [129].

Определении фосфор-кислородного соотношение измерение поглощения кислорода и неорганического фосфора проводили по и др. [124]. Параллельно с определением поглощения кислорода в пробах определяли убыль неорганического фосфата, количество которого вычисляли по разнице его в контрольной и опытной пробе. Содержание неорганического фосфора определяли по методу и др. [124].

Общую активность лактатдегидрогеназы определяли фенилгидразиновым калориметрическим методом. Определение изоферментного спектра лактатдегидрогеназы проводили методом электрофореза на агаре по Маркелову, в модификации ( и др. [246]. Активность цитохромоксидазы (ЦХО) определяли реактивом НАДИ по Шергину [35].

Активность дегидрогеназ определяли по времени обесцвечивания метиленовой сини по [35], в модификации и др. [233]. Анализ активности ферментов аспаргиновой (АСТ) и аланиновой (АЛТ) трансаминаз в сперме хряков проводили по модифицированному методу Умбрайта.

Криоконсервацию спермы проводили на фторопластовой пластине в парах жидкого азота при температуре на пластине -85°С. Оттаивали замороженную сперму с помощью гидрооттаивателя конструкции ВИЖа ( и др., [101].

 

 

Схема исследований

Запись режима охлаждения спермы при замораживании осуществляли с помощью медь-константановой термопары ипотенциометра КСП-4.

Температурный (холодовой) шок сперматозоидов вызывали погружая флаконы с 3 мл спермы в воду с температурой 0 - 2°С.

Проверку оплодотворяющей способности сперматозоидов хряков проводили на свиноматках хозяйств «Достык», «Дидар» и «Аксункар» Южно-Казахстанской области. Свиноматок в охоте выявляли два раза в сутки с помощью хряка пробника. Осеменяли свиноматок двукратно, через 12 и 24 часа после выявления рефлекса неподвижности. Доза спермы для однократного осеменения содержала 3 млрд. поступательно подвижных сперматозоидов (ГОСТ 27775-88 Искусственное осеменение сельскохозяйственных свиней).

Результаты экспериментальных исследований обрабатывали методами вариационной статистики по Е. К, Меркурьевой [243].

3 ОБОБЩЕНИЕ И ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Исследование возможности увеличение жизнеспособности спермы хряков при хранении in vitro в условиях температур от +18 до 0 0С

3.1.1 Исследование количественных показателей сульфгидрильных групп (SН-) в сперме хряков

Эякулированная, или «цельная» сперма хряков производителей представляет собой суспензию сперматозоидов в семенной плазме. Спермии образуются в семенниках в результате сперматогенеза, а семенная плазма, представляющая собой смесь секретов, продуцируется придаточными железами. У хряков 94-95% составляет вода, остальные 5-6% сухое вещество. Сперма хряков отличается высоким содержанием редуцицирующих сахаров, эрготионеина и инозита. По данным Т. Маnnа [34] эрготионеин – соединение тиоловой природы содержащие сульфгидрильные группы (SН-), выполняет роль естественного антиокислителя в экуляте, а также роль метаболического регулятора в энергетическом обмене.

Сперматозоиды хряков - это высокоспециализированные клетки, состоящие из головки, шейки, тела и хвоста, каждый из которых выполняет свою определенную функцию и имеет свои особенности строения. Нарушения функционирования любого отдела спермиев приводит к нарушению основной функции сперматозоидов - оплодотворения яйцеклеток. При этом 82,6% сухого вещества гамет самцов составляет белок, в них имеются многочисленные дисульфидные (-S-S-) связи.

Роль сульфгидрильных групп (SН-) низкомолекулярных тиолов и белков в сперме хряков обусловлена их участием в сложных биохимических процессах, обеспечивающих сперматозоиды энергией и создающих условия для процесса оплодотворения.

В настоящее время насчитывается свыше 100 ферментов, активность которых тормозится при блокировании содержащих в них SН-групп. Такие ферменты получили название тиоловых. Среди них имеются представители всех классов ферментов, катализирующих самые разнообразные химические превращения происходящих в клетке.

Методом ампериметрического титрования азоткокислым серебром нами изучено физиологический уровень SН-групп в эякуляте хряков производителей, а также связь концентрации сульфгидрильных групп в сперме с ее качественными показателями.

От 12 хряков крупной белой породы проведены исследования 59 эякулятов и установлено, что в 100 мл плазмы спермы содержится в среднем 67,3 мкмоль с колебаниями от 6 до 200 мкмоль сульфгидрильных групп. Результаты исследования представлены в табл.1. Как видно из таблицы у 32,2% эякулята в 100 мл плазмы спермы содержится 41-60 мкмоль сульфгидрильных групп, соответственно – у 23,8% 61-80 мкмоль, у 11,8% - 81-100 мкмоль SН-групп.

Изучено влияние интенсивности использование самцов на содержание SН-групп в плазме спермы. Установлено, что при переводе хряков на интенсивное использование параллельно с ухудшением качества спермы происходит резкое снижение концентрации SН-групп в плазме. При переводе хряка № 000 на ежедневное использование в первом эякуляте было 52 мкмоль, во втором - 46 мкмолей, в третьем - 46 мкмолей и в четвертом - 31 мкмолей сульфгидрильных групп на 100 мл плазмы. Возврат к умеренному режиму использования привело к постепенному восстановлению исходного уровня SН-групп.

Таблица 1- Распредление эякулятов хряков по содержанию SН-групп в плазме

Содержание SН-групп в 100 мл плазмы, мкмоль	Число эякулятов	В процентах
6 - 20	1	1,7
21- 40	9	15,2
41 - 60	19	32,2
61 - 80	14	23,8
81 - 100	7	11,8
101 - 120	4	6,8
121 - 140	3	5,1
141 - 160	1	1,7
160 - 200	1	1,7

Таким образом, наши эксперименты показали интенсивное использование самцов приводит не только к снижению качественных показателей, но и снижению уровня SН-групп плазмы спермы самцов. Отсюда следует, что видимо имеется определенная взаимосвязь между уровнем SН-групп плазмы и качественными показателями эякулята.

Изучено влияние сезонна года на содержание SН-групп плазмы спермы. Установлено, что в весенне-летний период концентрация SН-групп в плазме спермы выше на 24-29%, чем в осенние и зимние периоды года.

Аналогичные исследования по изучению содержанию сульфгидрильных групп в сперматозоидах проведены на 59 эякулятах хряков производителей. Эти данные по исследованию SН-групп в сперматозоидах представлены в таблице 2.

Таблица 2- Распределение эякулятов по содержанию SН-групп в сперматозоидах

Содержание SН-групп в 10 млрд. сперматозоидов, мкмоль	Число эякулятов	В процентах
5,1-7,0	9	15,2
7,1-9,0	15	25,4
9,1-11,0	19	32,2
11,1-13,0	10	17,0
Продожение таблицы 2.
13,1-15,0	4	6,8
15,1-17,0	1	1,7
17,1-19,0	1	1,7

Как видно из табл.2 содержание SН-групп в 10 млрд. сперматозоидов находится в пределах от 5,1 до 19,0 мкмоль, а в среднем составляет 8,7 мкмолей. Только у 3,4% хряков производителей содержание SН-групп на 10 млрд. сперматозоидов выше 15,1 мкмоль. У 15,2% производителей в 10 млрд. сперматозоидов содержится 5,1-7,0 мкмоль, соответственно у 25,4% - 7,1-9,0 мкмоль, у 32,2% хряков 9,1-11,0 мкмоль и 17,0% - 11,1-13,0 мкмоль SН-групп в 10 млрд. сперматозоидах.

Таким образом, в сперме хряков содержится значительное количество сульфгидрильных групп (SН-) низкомолекулярных тиолов и белков, которые по-видимому участвуют в сложных биохимических процессах протекающих клетках, а также в сохранении структурных элементов клетки, мембраны гамет и качественных показателей сперматозоидов.