Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 3 )

Теоретически обоснованы и предложены способы защиты сульфгидрильных групп спермы хряков с помощью тиоловых соединений и серосодержащих реагентов, вскрыты механизмы защиты спермы при их криоконсервации и оттаивания.

Впервые в практике технологии искусственного осеменения свиней изучены влияние низкомолекулярных тиоловых соединений на качественные показатели спермы хряков-производителей. Выявлены ряд новых, принципиально важных закономерностей, позволяющих существенным образом расширить и углубить теоретические и практические основы воспроизводства животных.

Впервые показана возможность повышения криоустойчивости сперматозоидов введением в среду криоконсервации низких концентраций веществ со специфическим и неспецифическим действием (низкомолекулярные SH-соединения, мочевина).

Определены параметры взаимосвязи между содержанием сульфгидрильных групп (SН-) спермы и ее качественными показателями.

Разработаны новые среды кратковременного хранения (+2-00С) глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловая (ГЦДУ) и долговремененного хранения глюкозо-цитратно-глицерино-дитиотреитоло-унитиоло-мочевино-желточная (ГЦДУМЖ) (-1960С). Применение разработанных сред позволить повысить эффективность использования высокоценных хряков-производителей.

Практическая значимость работы и реализация результатов исследований. Результаты экспериментальных исследований позволили расширить понимание молекулярных механизмов криоповреждений и криозащиты клеточных структур, определить способы и направление повышения криоустойчивости к повреждающему действию низких температур. Введение в состав среды криоконсервации унитиола и дитиотреитола увеличило результативность криоконсервации сперматозоидов хряка, а предложенный способ концентрирования спермы уменьшил потребность в хладагенте и емкостях для хранения замороженной спермы. Разработаны и представлены для внедрения:

- использования содержания сульфгидрильных групп для оценки качественных показателей и криоустойчивости спермы хряков;

- новая среда для кратковременного хранения, под условным названием глюкозо-цитрато-дитиотреитоло-унитиоловая (ГЦДУ);

- новая среда для криоконсервации спермы под условным названием глюкозо-цитратно-глицерино-дитиотреитоло-унитиоло-мочевино-желточная (ГЦДУМЖ);

Материалы диссертационной работы и результаты исследований могут быть использованы при разработке долговременного хранения генофонда исчезающих популяции, линий и пород животных Казахстана.

Основные положения, выносимые на защиту:

- количественные показатели сульфгидрильных групп в плазме эякулята и сперматозоидах и их влияния на качественные показатели спермы;

- влияние серосодержащих и тиоловых соединений на изменение окислительного фосфорилирования в сперматозоидах и качественные показатели свежеполученных и замороженных эякулятов;

- влияние серосодержащих и тиоловых реагентов на дегидрогеназную и цитохромоксидазную активность спермы;

- влияние охлаждения и замораживания-оттаивания на общую активность и изоферментный спектр фермента лактатдегидрогеназы;

- эффективность использования высокоценных хряков-производителей с новыми разработанными средами для хранения спермы в условиях кратковременного (+ 2 – 0 0С) и долговремененного хранения (-196 0С);

- параметры сохранности качественных показателей сперматозоидов после хранения с новыми разбавителями в производственных условиях;

- экономическая эффективность применение разработанных новых сред для спермы хряков-производителей.

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии при проведении экспериментов на всех ее этапах, интерпретации и обсуждении полученных результатов, их анализе и сопоставлении с известными литературными данными, обобщении и написании выводов диссертации.

Апробация работы. Результаты исследований (10) докладывались на научных конференциях: «Повышение продуктивных качеств сеьскохозиственных животных» (Санкт-Петербург 2010), «Стратегические вопросы мировой науки» (Przemysl 2011), «Перспективные научные исследования» (София 2011), «Наука и технологии: шаг в будущее» (Прага 2011), «Повышение интенсивности и конкурентноспособности отраслей животноводства» (Жадино 2011), «Астана Биотех 2011» (Астана 2011) «2nd International Conference on Agricultural and Animal Science» (Maldives 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано в 23 публикациях, в том числе в 4 изданиях, включенных в перечень Комитета по контролю в сфере образования и науки Республики Казахстан, 2 в отечественных научных журналах, 7 в зарубежной печати в том числе 1 статья была опубликована в международном научном издании, входящи в базу данных Thomson Reuthers.

Структура и объем диссертационной работы.

Работа состоит из 3 глав, введения, заключения, списка использованной литературы. Основное содержание работы изложено на 153 страницах машинописного текста, иллюстрировано 15 рисунками и 64 таблицами. Список литературы включает 246 наименований.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Выбор направления исследования основаны на работах ученых изучающих физико-химические процессы, происходящих при переохлаждении и появления сульфгидрильной теории. По этой теории все процессы происходящие при замораживании и оттаивании приводит к дегидратации белков клетки. При обезвоживании белковые молекулы сближаются и образуют дисульфидные (-S-S-) cвязи в результате окисления сульфгидрильных (SН) групп или реакции дитиол-дисульфидного обмена SН→ S - S, что приводит к денатурации белков клетки.

В связи с этим нами выбрана направления исследования по нахождению способов защиты сульфгидрильных групп спермы хряков с помощью тиоловых соединений и серосодержащих реагентов, вскрыт механизмы защиты половых клеток при их криоконсервации и оттаивания. Проанализированы полученные ранее результаты ученых по данной проблеме.

1.1 Теоретические основы хранения спермы животных in vitro и использования своийств sн-групп

1.1.1 Биохимические и cтруктурно - функциональные изменения сперматозоидов при охлаждении и замораживании-оттаивании

Гаметы позвоночных животных и человека являются одним из первых биологических объектов, подвергнутых замораживанию при низких и сверхнизких температурах. Спалланцани еще в 1787 году [по 1] описал восстановление подвижности сперматозоидов высших животных, подвергшихся замораживанию при температуре -15° С. [1] еще наблюдал восстановление двигательной способности сперматозоидов жеребца после охлаждения до -15°С и оттаивания. [2] было установлено, что сперматозоиды высших животных способны переносить охлаждение до -23°С и восстанавливать активность после оттаивания.

По результатам исследовании B. J. Luyet и E. L.Hadapp сперматозоиды кролика, охлажденные до -40°С [3] сохраняли оплодотворяющую способность после трехминутного пребывания при данной температуре. А в 1948 году [4] впервые в мире было получено многочисленное потомство от 61 крольчихи после осеменения спермой, подвергнутой глубокому охлаждению (-78... -196°С). Впоследствии этим же автором было получено потомство после осеменения овцематок глубокозамороженной спермой баранов [5]. В своих опытах автор пользовался методом витрификации.

Результаты исследовании и вторичного открытия защитного действия глицерина A. U.Smith и C. Polge, [6] исследования по замораживанию спермы животных получили более широкий размах. Обнаружились большие видовые различия в устойчивости сперматозоидов к действию низких и ультранизких температур. Исследованиями многих авторов установлены, что наиболее устойчивы к замораживанию сперматозоиды быков , [7]; буйволов А. Roy et al., [8], затем козлов и баранов [9]. Плохо переносят замораживание сперматозоиды жеребцов [10]. И, наконец, наименее устойчивыми оказались сперматозоиды хряка С. Polge [11]; [12]; [14]; [13].

Основные трудности замораживания сперматозоидов сопряжены с тем, что еще при охлаждении спермы до субнулевых температур даже небольшие отклонения в скорости охлаждения приводят к возникновению температурного шока и после замораживания-оттаивания они теряют оплодотворяющую способность маток.

Сообщения W. Baier [15] о получении потомства от осеменения свиноматок замороженной спермой этот опыт долгое время не удавалось повторить. Только в 1971 году появились сообщения E. F.Grahem и др. [16] и

B. G.Crabo и S. Einarson, [17] об успешных результатах замораживания спермы хряка при быстром охлаждении. В Советском Союзе первое потомство от замороженной спермы хряков было получено в ВИЖе [18] от трех основных свиноматок.

Микроскопические исследования сперматозоидов разных млекопитающих обнаружили большое сходство их во внешней морфологии и ультраструктурной организации внутренных строении.

Reed, и В. Reed [19]; L. Brwtshneider [20]; J. L.Hancock [21] показали, что сперматозоид состоит из головки, шейки и хвоста. Все отделы сперматозоида ограничиваются протоплазматической мембраной.

Исследованиями L. Nicander, А. Bane [22] и [23] установлена, что головка сперматозоида представлена в виде овальной несколько вогнутой и суживающей пластинки длиной 7...9 микрон и толщиной 1-1,2 микрона. Ширина его у вершины около 4 микрон и у основания 1,7...2,5 микрона [20].

При быстром охлаждении (температурный шок), замораживании-оттаивании и при хранении спермы быков, баранов и хряков. При 0°С как показали результаты световой и электронной микроскопии проведенные J. Hancock, [24]; P. F.Watson, J. M. Plummer [25]; [26]; V. G. Pursel [27] прежде всего повреждается акросома сперматозоидов.

По характеру изменений акросомы и плазматической мембраны головки может быть самым различным. Оболочка (плазматическая) отслаивается и разрывается. У большинства клеток, при сохранении целостности, оболочка вздувается, становится складчатой, в случае повреждения оболочка становится сильно складчатой, местами разрывается или совершенно отсутствует. Акросома расслаивается, либо ее оболочки образуют складки с разрывами. Ядро иногда может потерять гомогенность, а ядерные оболочки отслаиваются. Подобного характера изменения наблюдали К. Abraham и Р. Bhargava [28] на сперматозоидах быка и буйвола при хранении при температуре 0°С. Такого же типа изменения обнаружили A. W. Blackshfw и C. W. Salisbury [29] после замораживания-оттаивания сперматозоидов жеребца. Установлено, что в случае холодового шока эти изменения зависят от силы удара низких температур.