Разработка эффективных компонентов среды для криоконсервации спермы хряков (стр. 27 )

Нами, изучено влияния на уровень АТФ в сперматозоидах в различных способах разбавления спермы хряков перед замораживанием, представлено в таблице 58.

Анализ таблицы 58 показывают, что способ разбавления спермы перед замораживанием оказывает определенное влияние на содержание АТФ в сперматозоидах после замораживания-оттаивания и на их подвижность. Так, сразу после разбавления содержание АТФ в пробах с диализной обработки была выше контроля на 6,5 нмоль/108кл (или выше на 12,5%). Более лучшая сохранность АТФ при диализной обработке наблюдается и после криоконсервации-оттаивания спермы хряков.

Таблица 58- Влияние способа разбавления спермы перед замораживанием на содержание АТФ в сперматозоидах

Время исследования АТФ	Общепринятое разбавление спермы	Диализная обработка
подвижность сперматозоидов, %	содержание АТФ, нмоль/108кл	подвижность сперматозоидов, %	содержание АТФ, нмоль/108кл
Перед замо­раживанием	82,3±5,9 х	26,3±2,1	82,3±5,9	32,8±2,2 ХХ
Через 5 мин. после оттаивания	31,6±2,7	15,8±1,9 х	33,8±2,3	19,2±0,9 ХХ
Через 60 мин. после оттаивания	19,4±1,1	5,2±0,6	22,3±1,6	7,0±0,3
Через 120 мин. после оттаивания	14,6±1,6	4,6±0,2	19,8±0,9	6,2±0,5
х-Р<0,05; ХХ-Р<0,01

Разница по содержанию АТФ между общепринятым методом разбавление спермы и диализной обработкой составила через 5 мин. после оттаивания - 3,4 нмоль/108кл (или выше на 12,1%), Эт разницы наблюдается до двух часов после оттаивания спермы хряков. В частности через 60 мин. - 1,8 и через 120 мин. – 1,6 нмоль/108кл (или выше на 13,5%). Таким образом, при диализной обработке выявлено более высокое удержание АТФ по сравнению с общепринятым способом разбавления. В диализной группе также отмечено менее резкое снижение подвижности оттаянных сперматозоидов.

Поученные данные свидетельствуют о том, что диализный метод разбавления спермы хряков способствует более эффективной защите сперматозоидов в процессе их криоконсервации. Вероятно, это объясняется лучшими условиями стабилизации мембранных структур сперматозоидов в процессе эквилибрации. Кроме того, при этом из состава спермы могут удаляться низкомолекулярные компоненты, оказывающие биодеструктивное влияние на мембраны сперматозоидов.

Таким образом, проведенные лабораторные и производственные эксперименты в свиноводческих хозяйствах Южного Казахстана свидетельствуют, что диализный метод разбавления спермы хряков перед замораживанием оказывает больший криозащитный эффект на половые гаметы в сравнении с общепринятым методом разбавления эякулятов.

Влияние тиоловых соединений на показатель энергетического обмена в сперме хряков на разных этапах замораживания представлены в таблице 59.

Таблица 59- Влияние тиоловых соединений на показатель энергетического обмена в сперме хряков на разных

этапах замораживания

Вариант опыта	Свежеразбавленная сперма	Сперма после эквилибрации	Замороженно-оттаяная сперма
Vэнд			Vэнд			Vэнд
ГХЦЖКМ - контроль	78,7±8,1	1,09	2,87	93,4±8,4	1,29	2,88	73±5,7	1,23	1,68*
ГХЦЖКМ - унитиол	63,7±5,2	1,18	3,16	97,2±7,3	1,24	3,01	55,1±4,4	1,55	1,79*
ГХЦЖКМ- меркаптоэтанол	77,8±8,4	1,08	3,39	98,2±7,5	1,01	2,66	62,4±5,1	1,52	1,46*
ГХЦЖКМ-цистеин	-	-	2,28	-	-	-	59,7±6,2	1,31	1,47*
ГХЦЖКМ- дитиотреитол	61,6±5,3	1,15	3,02	94,2±7,7	1,22	2,84	52,7±6,2	1,52	1,72*
ПРИМЕЧАНИЕ: *Р<0,05 – достоверна по отношению к контролю Vэнд – скорость эндогенного дыхания Vсц – скорость дыхания с суцинатом Vднф – скорость дыхания с динитрофенолом

Анализ таблицы 59 показывают, что в целом тиоловые соединение способствуют сохранению более высокой степени АТФ в сперме.

Другой причиной снижения активности цитохромоксидазы в пробах с меркаптоэтанолом является усиление свободного окисления не связанного с синтезом АТФ, что видно по низкой величине стимуляции дыхания с ДНФ, VДНФ/ Vсукц =1,47 против 1,7 в контроле. Доля свободного окисления в пробах спермы разбавленной средой содержащей меркаптоэтанол возрастает уже при охлаждении спермы до +40С перед ее замораживанием.

Величина стимуляции дыхания ДНФ после эквилибрации по сравнению со стимуляцией дыхания свежеразбавленных сперматозоидов падает от 3,40 до 2,70. В то же время унитиол оказал значительное защитное действие на сохранность сопряженности дыхания с фосфорилированием. Как видно из таблицы 59 величина стимуляции дыхания сперматозоидов с ДНФ - (VДНФ/Vсукц) в сперме разбавленной средой с унитиолом выше контроля и после эквилибрации 3,01 против 2,90, и после замораживания-оттаивания - 1,78 против 1,69.

3.3.7 Влияние унитиола на общую активность и изоферментный спектр лактатдегидрогеназы

Полученные ранее данные показали что, введение унитиола в среду ГХЦЖК при замораживании спермы хряков увеличивает абсолютный показатель живучести сперматозоидов и обеспечивает сохранность лактатдегидрогеназы сперматозоидов хряка после их замораживания-оттаивания лучше, чем другие тиоловые соединения. Поэтому в следующей серии экспериментов поставлена задача - изучение влияние унитиола на активность лактатдегидрогеназы и ее изоферменты.

Опыты были поставлены в конце февраля и начале марта на хряках крупной белой породы. Эякуляты семени от опыта к опыту сильно отличались друг от друга по объему и концентрации сперматозоидов. В связи с этим к каждому варианту опыта ставили свой контроль.

Результаты опытов по изменению общей активности лактатдегидрогеназы и ее изоферментного спектра при разбавлении спермы средой, после эквилибрации и замораживания-оттаивания представлены в таблице 60.

Анализ таблицы показывают, что при разбавлении спермы средой с унитиолом (0,028%) - ГХЦЖКУ (опыт) происходит увеличение активности фермента как в сперматозоидах так и плазме. В частности активность ЛДГ в сперматозоидах после разбавления спермы средой ГХЦЖК (контроль) равна 6,74 мкМ пировиноградной кислоты на 109 клеток. Унитиол (среда ГХЦЖКУ) увеличивает активность фермента в сперматозоидах до 7,99 мкМ, что на 18,5% выше активности, чем в контроле (P<0,01). В плазме спермы опытной группы активность лактатдегидрогеназы составило - 2,85 мкМ, а контроле - 4,81 мкМ. Достоверность полученных результатов Р=0,01.

После эквилибрации спермы при температуре +5° С в течение трех часов происходит значительное снижение активности фермента в сперматозоидах: в среде ГХЦЖК до 5,44 мкМ и в среде ГХЦЖКУ (опыт) до 5,70 мкМ.

После замораживания-оттаивания спермы активность лактатдегидрогеназы сперматозоидов в контроле снижается до 3,71 мкМ. Это составляет - 55% от активности фермента после разбавления спермы. Значительное (на 33%) снижение активности лактатдегидрогеназы после замораживания наблюдается и в опытном варианте. Но разница активности между опытным и контрольным вариантами в этом случае больше 38% по сравнению с разницей в свежеразбавленной сперме (19%). Это свидетельствует, что выход фермента из сперматозоидов и ее инактивация в среде с унитиолом (ГХЦЖКУ) на 19% меньше чем в контрольной среде (ГХЦЖК).

Установлено что, активность лактатдегидрогеназы в плазме спермы после замораживания-оттаивания возрастает. Так это увеличение на 1 мл плазмы в контроле составило 3,3 мкМ и в опыте 3,4 мкМ.

Электрофоретическое разделение лактатдегидрогеназы на отдельные изоферменты показало, что активность ЛДГ4 и ЛДГ5 значительно превышает активность остальных изоферментов и в сперматозоидах и в плазме спермы. После разбавления спермы средой ГХЦЖК (контроль) активность ЛДГ4 и ЛДГ5 в сперматозоидах составило соответственно 33,4 и 44,9% от суммарной активности всех изоферментов лактатдегидрогеназы (табл. 28). Разбавление спермы средой с унитиолом (0,028%) вызывает некоторое изменение процентного соотношения изоферментов. При этом, по сравнению с контролем наблюдается увеличение активности изофермента ЛДГ2 в сперматозоидах. Активность ЛДГ1, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5 достоверно не меняются как в контроле, так и в опытных группах.

После эквилибрации процентное соотношение изоферментов в опытной среде ГХЦЖКУ, не отличается от соотношения в контрольной среде.

Замораживание-оттаивание вызывает уменьшение активности ЛДГ1 в среде ГХЦЖК, а в опыте наблюдается снижение соотношения изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ3 сперматозоидов по сравнению с их активностью после разбавления семени. Активность ЛДГ4 и ЛДГ5 в среде с унитолом после замораживания достоверно не отличается от активности остальных групп.